利用生物反應(yīng)器,高密度生長的微藻萊茵衣藻優(yōu)化活性重組蛋白產(chǎn)物

微藻已被確定為生產(chǎn)高質(zhì)量生物質(zhì)和后續(xù)生物產(chǎn)品(如食品、飼料、營養(yǎng)補(bǔ)充劑、重組蛋白和生物燃料)的替代平臺。治療性蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)生物技術(shù)宿主,如大腸桿菌和哺乳動物CHO細(xì)胞,早已被確定為主要平臺,但最近的研究進(jìn)展表明,微藻可能成為一種替代平臺。在本研究中,我們研究了萊茵衣藻在高密度異養(yǎng)培養(yǎng)中生產(chǎn)復(fù)雜人類重組蛋白的潛力。重組人蛋白ICAM-1的目標(biāo)是使用補(bǔ)料分批策略從生物反應(yīng)器中生長的細(xì)胞分泌到培養(yǎng)物的細(xì)胞外培養(yǎng)基,以實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度。最終,這導(dǎo)致最大生物量滴度為40 g/L,重組蛋白滴度為50 mg/L。通過對其天然配體LFA-1的結(jié)合測定,藻類產(chǎn)生的ICAM-1蛋白顯示出與哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的ICAM-1相當(dāng)?shù)纳锘钚浴_@項(xiàng)工作表明,萊茵梭菌是使用補(bǔ)料分批異養(yǎng)生長策略在高濃度下生產(chǎn)具有天然生物活性的復(fù)雜重組蛋白的可行選擇。

工藝流程圖

微藻是一類高度多樣的生物,主要由其光合生長能力來定義,盡管許多藻類也具有在有機(jī)基質(zhì)上異養(yǎng)生長的能力。由于代謝的可塑性和潛在的培養(yǎng)策略,微藻可用于生產(chǎn)廉價的商品產(chǎn)品,如生物燃料和材料,以及高價值產(chǎn)品,如重組蛋白質(zhì)和治療性化合物。萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)就是這樣一種既能自養(yǎng)又能異養(yǎng)生長的菌株,它是一種綠色微藻,幾十年來一直被用作模式生物,用于研究各種生物現(xiàn)象,包括光合作用、鞭毛運(yùn)動、細(xì)胞器遺傳學(xué)和細(xì)胞周期[5]。最值得注意的是,該物種擁有一套開發(fā)的分子工具來促進(jìn)遺傳操作,多年來,該藻類中已經(jīng)產(chǎn)生了許多重組蛋白

由于之前在萊茵梭菌中所做的分子生物學(xué)工作,所有三個基因組(核、葉綠體和線粒體)都已測序和注釋,并且所有三個都能夠進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。此外,重組蛋白在葉綠體和核基因組中都有表達(dá),復(fù)雜的哺乳動物蛋白在兩個基因組中都有表達(dá)。C、 reinhardtii還能夠進(jìn)行有性重組,這已被證明是在轉(zhuǎn)基因策略和高通量篩選技術(shù)的基礎(chǔ)上增加重組蛋白產(chǎn)量的有效手段[14]

萊茵梭菌的重組蛋白生產(chǎn)傳統(tǒng)上在葉綠體中更為成功,因?yàn)槠溥z傳學(xué)更為簡單,而且單個細(xì)胞器可以占細(xì)胞體積的70%。一些感興趣的重組蛋白已在葉綠體中表達(dá),在非光合突變株[15]中產(chǎn)量高達(dá)總可溶性蛋白(TSP)的10.5%,但更典型的是TSP的0.5%到5%不等。葉綠體中重組蛋白生產(chǎn)的缺點(diǎn)是,一些翻譯后修飾沒有添加到葉綠體生產(chǎn)的蛋白質(zhì)中,例如糖基化,這可能對蛋白質(zhì)的生物活性至關(guān)重要,并且葉綠體中表達(dá)的重組蛋白不能針對其他亞細(xì)胞定位,阻礙某些代謝工程的可能性。在細(xì)胞核中表達(dá)的重組蛋白可以靶向細(xì)胞內(nèi)的不同位置,包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng),從而接受翻譯后修飾,如糖基化。復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控,以及對轉(zhuǎn)基因隨機(jī)整合到核基因組的強(qiáng)烈偏好,阻礙了核轉(zhuǎn)基因的重組蛋白表達(dá)。據(jù)報道,通過核基因組轉(zhuǎn)化獲得的重組蛋白滴度范圍為0.7 mg/L至15 mg/L,這對應(yīng)于大多數(shù)核表達(dá)重組蛋白的總可溶性蛋白滴度為0.5%或更低。

提高萊茵梭菌中的重組蛋白滴度,我們可以控制三個因素:單個細(xì)胞系中的重組蛋白產(chǎn)量、培養(yǎng)物中的總生物量濃度以及重組蛋白在細(xì)胞內(nèi)或培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性。為了直接增加單個細(xì)胞系中的重組蛋白產(chǎn)量,我們可以修改啟動子或其他遺傳元件以增加轉(zhuǎn)錄,或通過使用誘變和交配進(jìn)行間接遺傳修改,然后進(jìn)行篩選以識別蛋白質(zhì)積累增加的系。這些間接遺傳修飾可能涉及阻礙重組蛋白積累的天然蛋白酶的下調(diào),或者可能涉及伴侶和其他促進(jìn)重組蛋白折疊的酶的改變,從而減少新合成蛋白質(zhì)的聚集和降解。通過改變培養(yǎng)物生長條件,例如降低培養(yǎng)物溫度以防止錯誤折疊,也可以影響重組蛋白降解和/或聚集的預(yù)防[23]。最后,只要在這些改變的生長條件下蛋白質(zhì)表達(dá)保持高水平,增加總生物量濃度也是提高重組蛋白產(chǎn)量的有效途徑。這可以通過改進(jìn)培養(yǎng)技術(shù)、優(yōu)化培養(yǎng)基或選擇在高生物量生長下表現(xiàn)良好的菌株來實(shí)現(xiàn)。

在簡單的分批生長中,最終生物量滴度受分批運(yùn)行開始時添加的基質(zhì)量的限制。最常見的消耗醋酸鹽作為有機(jī)碳基質(zhì),然而,培養(yǎng)基中高濃度的醋酸鹽抑制藻類生長,從而限制了產(chǎn)生的總生物量。當(dāng)使用補(bǔ)料分批策略時,醋酸鹽可以在細(xì)胞消耗時超時添加,因此可以避免底物抑制的問題。幾種策略已被用于萊茵梭菌的補(bǔ)料分批生長。據(jù)報道,使用乙酸鈉的補(bǔ)料分批系統(tǒng)可產(chǎn)生1.5 g/L的生物量,但鈉的累積會抑制進(jìn)一步的生長。為了解決這個問題,同一團(tuán)隊設(shè)計了一個中空纖維細(xì)胞回收系統(tǒng),在該系統(tǒng)中,使用過的培養(yǎng)基被丟棄,而細(xì)胞被保存在生物反應(yīng)器中,從而產(chǎn)生9克/升。Fields等人部署的另一種分批補(bǔ)料策略包括使用pH計喂食萊茵梭菌乙酸,以控制酸性基質(zhì)的添加,這導(dǎo)致報告的最高生長速率和生物量滴度為23.69 g/L生物量。然而,與其他能夠消耗葡萄糖作為基質(zhì)的綠藻(如小球藻和柵藻)相比,即使是生長中獲得的最高生物量滴度也大大降低,其中生物量滴度分別達(dá)到271 g/L和286 g/L。

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