微藻營養(yǎng)豐富,是魚、蝦、貝等經(jīng)濟動物人工育苗的基礎(chǔ)。特別是海洋微藻,由于富含EPA和DHA,在許多方面受到人們的青睞。在微藻的培養(yǎng)和應(yīng)用中,保種技術(shù)十分重要,它是微藻培養(yǎng)和進一步應(yīng)用的基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于藻種極易受污染,分離培養(yǎng)方法比較復(fù)雜而且耗時較長,因此,在微藻保種工作中要盡量減少接種次數(shù),避免藻種被雜藻、細菌或原生動物污染,既能達到長期貯藏種質(zhì)的目的,又能維持藻種的活性,是微藻科研工作者努力的方向之一。本文就微藻保存的幾種常用方法介紹如下。
繼代保存法是目前普遍采用的方法,使用于一切藻種的保存。通常在常溫或常低溫進行。常溫一般指15℃~25℃,常低溫一般指0℃~15℃,藻種可接種在固體、液體或雙相培養(yǎng)基中。接種后應(yīng)首先放在適宜的光照條件下培養(yǎng),待藻細胞生長繁殖達到較高密度,可見明顯的條狀或塊狀的藻細胞群時,再移置低溫、弱光的條件下保藏。保藏半年到1年后必須進行轉(zhuǎn)接。此方法簡單易行,但是保存時間短,而且繼代頻繁,容易發(fā)生污染和變異。
固定化細胞(1mmobilized cells)是指將游離細胞包埋在多糖或多聚化合物制成的網(wǎng)狀支持物中,固定載體束縛藻種,影響其代謝過程,從而抑制細胞的生長和分裂。固定化微生物技術(shù)是在20世紀60年代固定化酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,1978年以來,固定化技術(shù)就被用來作為延長光合細胞壽命的一種重要手段。但微藻存活時間從1個月到幾年不等。張繼紅將三角褐脂藻固定在褐藻酸鈣凝膠中,可保存3~5年;Tamponnet等報道了固定化纖細裸藻存活2年;矮小海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)和賀氏鈣板金藻 (Emiliana hux liyi)僅能保存3個月。近來孟妍等人采用褐藻膠包埋技術(shù)與干燥脫水技術(shù)相結(jié)合將綠色巴夫藻常溫保存,保存時間可達6個月存活率高達77.6%。
固定化保種技術(shù)對多數(shù)微藻是適用的,該法可以在常低溫下實現(xiàn)對藻類的中期保存,培養(yǎng)保存時間較長,活化復(fù)蘇快,技術(shù)設(shè)備簡單,細胞外滲少,而且可用于次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn)。在一般的微藻實驗室內(nèi)都能進行。但固定化程序較復(fù)雜,大多數(shù)微藻在培養(yǎng)后期常會從膠珠中溢出。而且,現(xiàn)有的資料表明,某種固定化方法只適用一定種類的微藻,對于其他種類的微藻會有不同的反應(yīng),原因復(fù)雜,還需要做更深入、廣泛的研究。這就給固定化保種技術(shù)的推廣帶來了一定的困難。
所謂超低溫保存區(qū)別于其他低溫概念的冰箱溫度(4℃~~40℃)和干冰溫度(~79℃),是指在液氮低溫(~196℃)下保存。此時生物體的物質(zhì)代謝和生長活動幾乎完全停止。可是它們?nèi)蕴幱诳赡娴某苫顮顟B(tài)。早在20世紀70年代,英國的Morris等就對海產(chǎn)單胞藻進行了超低溫保存研究,取得了在~196℃下保存1年,存活率100%的結(jié)果。目前普遍采用兩步冷凍法,即慢速降溫進行冷適應(yīng),然后投入液氮中保存。王起華等用兩步冷凍法研究了3種餌料金藻,其存活率均在30%左右。
超低溫保存法具有保持種質(zhì)遺傳穩(wěn)定性、對藻種進行優(yōu)勝劣汰、便于長期保存、能最大限度地減少污染等方面的優(yōu)點,還能省去藻種的活力監(jiān)測和繁殖更新。但微藻的種類很多,生理狀態(tài)各異,適宜的保存條件各不相同,找出不同微藻的超低溫保種方法困難,而且不同的細胞要求不同類型、不同濃度的抗凍劑, 至今還沒有找出1種對所有種類都適用的保護劑。但隨著研究的深入,在探明生物細胞凍害和抗凍機理的基礎(chǔ)上,超低溫保存微藻藻種的應(yīng)用前景將會是十分光明的。
濃縮低溫保存法是將藻液高密度培養(yǎng)后,采用物理、化學(xué)的方法濃縮1000倍左右,再低溫保存。國外自80年代末開始就有對海洋經(jīng)濟微藻的濃縮方法和低溫保存方法進行研究,取得了不少的研究成果,其中美國、英國和日本已有相應(yīng)的產(chǎn)品(微藻濃縮細胞或稱“藻膏”)問世。蔣霞敏等將小球藻和球等鞭金藻301(1sochrysis galbana Park)濃縮后,在5℃~7℃的冰箱中保存1~3個月后恢復(fù)生長獲得好于常溫的效果。孫建華、王如才(1993)對小新月菱形藻(Nitzschia closterium)、球等鞭金藻的濃縮和保存方法進行了研究,濃縮藻液在1℃~4℃的低溫下加保護劑SAMs保存3個月,復(fù)蘇后效果良好。
濃縮低溫保存多用于海洋微藻。微藻濃縮液的生產(chǎn),可以使海洋微藻的生產(chǎn)與使用保留一定的時間差。但相對保存時間較短,海洋微藻的抗逆原理還有待作更多的研究和探討。
冷凍真空干燥保存法是在極低溫度下(~70℃左右)快速冷凍,然后在極低溫度下真空干燥,使藻種的新陳代謝活動處于高度靜止狀態(tài)。19世紀末Fkral與Mudd創(chuàng)立的冷凍真空干燥法是迄今公認最佳的藻種保存法,嚴珍等選擇脫脂牛奶作為保護劑,將藻液放入安瓿管中,冷凍、干燥并抽真空,火焰熔封。在低溫避光處保存,預(yù)計最大保存年限為18年。冷凍干燥保存法優(yōu)點是微藻復(fù)蘇效果好,保藏期內(nèi)可避免其他雜菌污染,便于攜帶運輸,易實現(xiàn)商品化生產(chǎn);其缺點是操作繁瑣、對設(shè)備要求高等;應(yīng)用前景十分光明。
低溫甘油生理鹽水法是對甘油原液保存法的改進。加入生理鹽水適當(dāng)降低了甘油的高滲作用,更有利于藻種的保存。在藻液中人一定的甘油作保護劑,同時加入一定的生理鹽水,混勻后直接放置在~20℃±0.5℃冰箱放置保存。保存時間長,一般3年左右。
綜上所述,單細胞藻類的保種技術(shù)尚沒有發(fā)展成為一項成熟穩(wěn)定的技術(shù),許多問題還有待于我們?nèi)ヌ剿?,開展微藻保種方面的研究工作,不但會填補微藻保種理論研究上的空白,還會在生產(chǎn)實踐中發(fā)揮應(yīng)有的作用。