????????據(jù)了解，該發(fā)明是特拉維夫大學(xué)波特環(huán)境與地球科學(xué)學(xué)院亞歷山大·戈?duì)柌└癫┦颗c化學(xué)學(xué)院米歇爾·哥津教授進(jìn)行學(xué)科交叉合作的成果。研究成果發(fā)表在《生物資源技術(shù)》雜志上。

????????據(jù)聯(lián)合國(guó)統(tǒng)計(jì)，塑料占海洋所有污染物的90%，卻幾乎沒(méi)有特別有效的環(huán)保替代品。

????????“塑料數(shù)百年才能腐爛。塑料也是由石油產(chǎn)品生產(chǎn)的副產(chǎn)品，生產(chǎn)過(guò)程會(huì)釋放化學(xué)污染物?！备?duì)柌└癫┦空J(rèn)為，“生物降解塑料是解決方案之一，其不使用石油，還能迅速降解。但是，生物塑料也有環(huán)境價(jià)格，培育相關(guān)的植物或細(xì)菌需要肥沃的土壤和淡水，但包括以色列在內(nèi)的許多國(guó)家都沒(méi)有這類條件?！?/span>

????????研究人員利用以海藻為食的微生物，生產(chǎn)一種叫做聚羥基鏈烷酸酯（PHA）的生物塑料聚合物。這種海藻是能在海中種植的多細(xì)胞海藻，而一種能在非常咸的水中生長(zhǎng)的微生物，可以吃掉多細(xì)胞海藻并產(chǎn)生可用于制造生物塑料的聚合物。

????????這種新工藝將為淡水短缺的國(guó)家如以色列、中國(guó)和印度，從生產(chǎn)石油衍生塑料向生產(chǎn)生物降解塑料轉(zhuǎn)型提供相應(yīng)技術(shù)。

????????戈?duì)柌└裾J(rèn)為：“這項(xiàng)新研究將努力徹底改變世界清潔海洋的努力?！?/span>

????????現(xiàn)在，科研人員正在開展基礎(chǔ)研究，以找到最適合生產(chǎn)具有不同性質(zhì)生物塑料聚合物的最佳微生物和藻類。

????????總編輯圈點(diǎn)

????????以色列雖然土地貧瘠、資源短缺，卻堅(jiān)持走科技強(qiáng)國(guó)之路，其對(duì)人類科技發(fā)展的貢獻(xiàn)巨大。以色列科學(xué)家擅長(zhǎng)大處著眼、小處入手，總是鉆研“務(wù)實(shí)”的應(yīng)用技術(shù)。缺水，農(nóng)業(yè)就發(fā)明了滴灌技術(shù)把用水量限制到極致；缺生產(chǎn)塑料的土地，就在海水里想辦法制造可降解塑料……從實(shí)際問(wèn)題中來(lái)的技術(shù)解決方案，終將回到實(shí)際中去，進(jìn)而惠及人類。

論文解讀：

菌根共生是植物與菌根真菌建立的互惠互利的同盟，也是自然界最為廣泛的共生形式。植物可通過(guò)與菌根真菌共生高效率的從土壤中獲得磷和氮等營(yíng)養(yǎng)；同時(shí)植物把20%左右的光合作用產(chǎn)物傳遞給菌根真菌供其生長(zhǎng)。每年大約有50億噸的光合作用產(chǎn)物通過(guò)菌根真菌被固定在土壤中，對(duì)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的碳氮平衡具有重要的作用。傳統(tǒng)理論認(rèn)為糖是植物為菌根真菌提供碳源營(yíng)養(yǎng)的主要形式【1-3】，然而多年來(lái)的研究人員一直沒(méi)有找到相關(guān)的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

在這項(xiàng)研究中，王二濤團(tuán)隊(duì)通過(guò)C13同位素標(biāo)定實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)體系中用C13同位素標(biāo)同時(shí)標(biāo)定甘油（代表脂肪酸）和葡萄糖，但是最終在叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal，AM）中主要檢測(cè)到的是脂肪酸而不是糖，該結(jié)果從而首次否定了糖是植物傳遞給菌根真菌主要碳源形式。

同時(shí)，研究者采用遺傳學(xué)、分子生物學(xué)及代謝生物學(xué)的手段研究發(fā)現(xiàn)，植物宿主的脂肪酸合成對(duì)于叢枝菌根真菌共生是必須的，并且植物合成的脂肪酸能夠直接傳遞給菌根真菌。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)植物基因合成的一類特殊脂肪酸分子（2-monoacylglycerol，2-單酰甘油，由RAM2催化合成），被植物的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白STR-STR2（一類ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）轉(zhuǎn)運(yùn)給菌根真菌。該研究系統(tǒng)揭示了脂肪酸是光合作用碳源的主要傳遞形式，推翻了傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)，對(duì)于理解生態(tài)系統(tǒng)的碳氮循環(huán)具有重要的意義。

同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，在植物病原真菌相互作用中，病原真菌和寄主植物爭(zhēng)奪脂肪酸作為其生長(zhǎng)的碳源，進(jìn)而侵染植物，造成作物的減產(chǎn)。通過(guò)降低植物病原真菌相互作用中脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，能夠有效的抑制病原真菌的致病性。該機(jī)理的揭示有助于將來(lái)選育抗真菌病害作物，也為“綠色農(nóng)業(yè)”提供了有利的支撐。

據(jù)《上觀新聞》報(bào)道，其實(shí)早在2010年，還在英國(guó)從事博士后研究時(shí)的王二濤博士在克隆一些共生植物基因時(shí)，就發(fā)現(xiàn)“糖”理論無(wú)法解釋一些現(xiàn)象。他曾經(jīng)提出了質(zhì)疑，并大膽假設(shè)了另一種可能——脂肪酸是碳源營(yíng)養(yǎng)的主要形式，但是卻并未獲得該領(lǐng)域研究人員的認(rèn)可，畢竟“糖”理論已經(jīng)寫進(jìn)了教科書。一直到2013年，王二濤學(xué)成回國(guó)組建了自己的研究組，他依然沒(méi)有放棄這一想法。特別令人欽佩的是，王二濤在回國(guó)后的短短幾年里帶領(lǐng)課題組的成員就實(shí)現(xiàn)了他當(dāng)初的想法，而且該成果投稿過(guò)程出奇的順利，這無(wú)疑給了許多年輕的科研人員一些信心。也提醒一些年輕科研人員（特別是博士生和博后）當(dāng)你有了好的想法一時(shí)無(wú)法實(shí)現(xiàn)的時(shí)候千萬(wàn)不要放棄，等哪天有條件說(shuō)不定就真的可以實(shí)現(xiàn)并且是顛覆性的發(fā)現(xiàn)。

據(jù)悉，該工作是與福建農(nóng)林大學(xué)唐定中研究員和中科院植生所楊琛和陳曉亞研究員合作完成。該工作主要由姜伊娜博士和博士研究生王萬(wàn)曉、謝秋瑾等在王二濤研究員指導(dǎo)下完成?？萍疾壳嗄?73、國(guó)家轉(zhuǎn)基因新品種培育重大專項(xiàng)、國(guó)家自然科學(xué)基金委等資助。

關(guān)于這項(xiàng)研究工作，論文審稿人給予很高的評(píng)價(jià)，其中一位評(píng)審人認(rèn)為“This is a very interesting paper that provides novel insights into the nutrient relationship between arbusular mycorrhizal fungi and their host plant”。

說(shuō)明：本文報(bào)道的內(nèi)容主要引自中科院植生所官網(wǎng)。

參考文獻(xiàn)：

1、Pfeffer, P. E., Douds, D. D., Bécard, G., &Shachar-Hill, Y.(1999). Carbon uptake and the metabolism and transport of lipids in an arbuscular mycorrhiza. Plant Physiology, 120(2), 587-598.

2、Bago, B., Pfeffer, P. E., & Shachar-Hill, Y.(2000). Carbon metabolism and transport in arbuscular mycorrhizas. Plant physiology, 124(3), 949-958.

3、Bago, B., Zipfel, W., Williams, R. M., Jun, J., Arreola, R., Lammers, P. J., … & Shachar-Hill, Y.(2002). Translocation and utilization of fungal storage lipid in the arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Physiology, 128(1), 108-124.

王二濤，博士，現(xiàn)任中科院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所研究員，2014年中組部“青年千人計(jì)劃”入選者。1999-2003年畢業(yè)于河南大學(xué)，獲學(xué)士學(xué)位；2003-2008年畢業(yè)于中科院上海生命科學(xué)研究院，獲博士學(xué)位（導(dǎo)師：何祖華研究員）；2008-2012年在英國(guó)John Innes Centre從事博士后研究；2013年至今，任中科院上海植物生理生態(tài)研究所研究員，植物分子遺傳國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究員，國(guó)際非豆科植物生物共生固氮研究聯(lián)盟成員。主要從事植物-微生物共生和相關(guān)激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究，在植物-微生物共生研究方面取得了一系列突破。近年來(lái)以第一作者或通訊作者身份在包括Science、Nature Genetics、Current biology、The Plant Cell、Cell Research、Molecular Plant等國(guó)際主流學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表多篇研究性論文，對(duì)相關(guān)領(lǐng)域有廣泛的影響。

試劑

0.2 mol/ L磷酸鹽緩沖液?
Na₂HPO₄·2H₂O? 35.61 g 或Na₂HPO₄·7H₂O 53.65 g / Na₂HPO₄·12H₂O 71.64 g
NaH₂PO₂·H₂O? 27.60 g 或NaH₂PO₄·2H₂O? 31.21 g
加雙蒸水（ddH2O）到1000 mL
0.1 mol/ L磷酸鹽緩沖液（PBS）?
0.2 mol/ L磷酸鹽緩沖液? 250 mL
加雙蒸水到500 mL
2 % 低溫瓊脂?
低溫瓊脂? 1.0 g
加雙蒸水到 50 mL
加熱到沸騰，溶液均勻后備用
1 % 戊二醛固定液?
25 %（m/v）戊二醛水溶液? 2 mL
0.2 mol/ L磷酸鹽緩沖液? 25 mL
加雙蒸水到50 mL
1 % 鋨酸固定液?
2 %（m/v）鋨酸水溶液?? 10 mL
0.2 mol/ L磷酸鹽緩沖液? 10 mL
包埋劑A液?
Epon 812 樹脂? 50 mL
十二烷基琥珀酸酐（modecenyl succinic anhydride, DDSA）? 80 mL
包埋劑B液?
Epon 812 樹脂? 50 mL
六甲酸酐（methyl nadic anhydride, MNA）? 44.5 mL
2，4，6 –?三甲氨基甲基苯酚（2, 4, 6 – tridimethylamino methyl phenol, DMP-30）?
甲苯胺藍(lán)染液?
甲苯胺藍(lán)? 1 g
1 mol/ L NaOH? 10 mL
加雙蒸水到50 mL
混勻過(guò)濾后使用
1 % 醋酸雙氧鈾染液
醋酸雙氧鈾? 0.2 g
加雙蒸水到10 mL
封口膜封口，4℃避光保存
1 % 檸檬酸鉛染液?
硝酸鉛? 0.265 g
檸檬酸鈉（含2分子結(jié)晶水）? 0.352 g
加雙蒸水到10 mL①
① 配制鉛染液時(shí)，要先加水6 mL，超聲震蕩30 min，使乳白色檸檬酸鉛懸液充分混勻。然后滴加1 mol/L NaOH，并不是晃動(dòng)，直至溶液變清亮。最后定容至10 mL。
② 細(xì)胞樣品處理和藻類及其他游離樣品處理流程可相互參照，即細(xì)胞樣品可以酌情使用瓊脂鑄模法取材固定，藻類及其他游離樣品也可以使用血清預(yù)包埋法取材固定，總體視樣品密度及其對(duì)于溫度的耐受等條件而定。
封口膜封口，4℃保存

儀器

修塊機(jī) Leica EM TRIM
切片機(jī) Leica EM UC6
光學(xué)顯微鏡 Nikon 80i 及配套拍照系統(tǒng)DS-L1
透射電子顯微鏡 JEOL-1230
Gatan Bioscan Camera 792

實(shí)驗(yàn)流程

一、 取材與固定
A. 植物樣品
1. 自來(lái)水沖洗表面泥塵后，使用滅菌水清洗2-3次，置于鋪有預(yù)濕濾紙的培養(yǎng)皿中。
2. 使用干凈鋒利的刀片切取目標(biāo)材料，所取材料體積不大于3 mm3。
切取樣品時(shí)應(yīng)注意動(dòng)作迅速、減小損傷，避免來(lái)回切拉；使用的滅菌水及器具應(yīng)4℃預(yù)冷，并在操作中盡量保持低溫以降低組織細(xì)胞活性。
3. 將切下材料放入裝有預(yù)冷的戊二醛固定液的青霉素小瓶中后抽氣，抽幾次后輕搖小瓶，并打開瓶蓋。重復(fù)2-3次，直到樣品沉入瓶底。
4. 室溫靜置1h，或搖床輕搖1h。
5. PBS清洗3次，10min/次。
6. 1%鋨酸固定液固定1h。
7. PBS清洗3次，10min/次。

B. 動(dòng)物樣品
1. 4℃預(yù)冷生理鹽水沖洗組織塊，迅速切取組織塊，體積不大于3 mm3
2. 將切取的組織塊投入裝有預(yù)冷戊二醛固定液的青霉素小瓶中，并抽氣直至樣品沉底。
3. 室溫靜置1h，或搖床輕搖1h。
4. PBS清洗3次，10 min/次。
5. 1%鋨酸固定液固定1 h。
6. PBS清洗3次，10 min/次。

C. 單層培養(yǎng)細(xì)胞或懸浮培養(yǎng)細(xì)胞樣品②
1. 3000 rpm離心5 min，收集細(xì)胞樣品，盡量多的吸棄培養(yǎng)液上清。
2. 加入4℃預(yù)冷PBS液，充分吹吸混勻，靜置4 min，3000 rpm離心5 min，吸棄上清。
① 配制鉛染液時(shí)，要先加水6 mL，超聲震蕩30 min，使乳白色檸檬酸鉛懸液充分混勻。然后滴加1 mol/L NaOH，并不是晃動(dòng)，直至溶液變清亮。最后定容至10 mL。
② 細(xì)胞樣品處理和藻類及其他游離樣品處理流程可相互參照，即細(xì)胞樣品可以酌情使用瓊脂鑄模法取材固定，藻類及其他游離樣品也可以使用血清預(yù)包埋法取材固定，總體視樣品密度及其對(duì)于溫度的耐受等條件而定。
3. 重復(fù)步驟2一次。
4. 加入預(yù)冷的血清或蛋清，充分吹吸混勻，3000 rpm離心10 min，吸棄大部分上清，留少部分，吹吸懸浮沉淀細(xì)胞。（或離心后吸棄上清，留少部分上清，不懸浮沉淀細(xì)胞，視樣品濃度而定）
5. 緩慢加入戊二醛固定液，小心放入4℃冰箱，固定過(guò)夜。
6. 吸棄上清，刀片小心劃開離心管壁，用鉗子拉開離心管，小心取出已凝成固體的血清包埋塊。
7. 使用干凈的單面刀片或手術(shù)刀，將血清包埋塊切成2 mm3左右的小塊，取3-5個(gè)富集細(xì)胞樣品效果較好的包埋小塊繼續(xù)下面實(shí)驗(yàn)。
8. PBS清洗3次，10 min/次。
9. 1%鋨酸固定液固定1 h。
10. PBS清洗3次，10 min/次。

D. 藻類及其他游離培養(yǎng)樣品
1. 吸取2%低溫瓊脂液200μL到0.2mL離心管，并將離線管置于冰上，取10μL槍頭迅速插入瓊脂中并保持離心管豎直，且槍頭豎直靠中的包裹在瓊脂中。
2. 靜置1 min，待瓊脂凝固后，小心拔出槍頭，形成瓊脂空腔，待用。
3. 3000 rpm離心5 min，收集樣品，盡量多的吸棄培養(yǎng)液上清。
4. 加入4℃預(yù)冷PBS液，充分吹吸混勻，靜置4min，3000 rpm離心5min，吸棄上清。
5. 重復(fù)步驟2清洗，吸棄大部分上清，留極少部分上清液，吹吸懸浮樣品。
6. 使用10μL 移液器小心將樣品加入已經(jīng)制備好的瓊脂空腔中，使樣品充滿空腔大部分，添加過(guò)程中盡量避免氣泡出現(xiàn)。
7. 吸取50μL溶化的瓊脂，快速滴加到空腔瓊脂上封口，冰浴5 min，待瓊脂完全凝固。
8. 使用單面刀片小心劃開離心管壁，用鉗子拉開離心管，小心取出已凝成固體的瓊脂包埋塊，稍作修葺。
9. PBS清洗3次，10 min/次。
10. 1%鋨酸固定液固定1 h。
11. PBS清洗3次，10 min/次。

二、 脫水

1. 按丙酮與滅菌水體積比3：7配制30%脫水劑。吸棄樣品管/瓶中的PBS，快速加入現(xiàn)配的脫水劑（脫水換液過(guò)程禁止出現(xiàn)樣品暴露空氣中現(xiàn)象，可不全部吸完，略有剩余，使樣品浸潤(rùn)；動(dòng)作應(yīng)迅速準(zhǔn)確），室溫放置或搖床輕搖45 min。加入按30%、50%、70%、90%、100%（v/v）的濃度梯度進(jìn)行脫水。
2. 配制50%脫水劑，快速換液，室溫輕搖45 min。
3. 配制70%脫水劑，快速換液，室溫輕搖45 min。
4. 配制90%脫水劑，快速換液，室溫輕搖45 min。
5. 使用純丙酮快速換液，室溫輕搖30 min③。
6. 重復(fù)步驟5一次。

三、 滲透包埋

在此步脫水操作完成后即可開始配制滲透用包埋劑，以免安排不周。樣品浸泡在純丙酮中時(shí)間不宜過(guò)久，以免造成樣品較脆，不利于超薄切片。

1. 配制滲透用樹脂包埋劑
1) 取干凈的10 mL注射器，拔去活塞，用封閉針頭堵住注射口，放于通風(fēng)櫥中。
2) 小心傾倒B液9 mL到注射器中；然后再小心傾倒A液1 mL。
3) 插入活塞，堵住注射器后，顛倒搖勻至液體顏色均勻，無(wú)絲狀液體。
4) 小心拔去活塞，通風(fēng)櫥中操作，緩慢滴加14滴DMP-30。
5) 插入活塞，堵住注射器后，顛倒搖勻至液體顏色完全均勻，無(wú)絲絮狀分色，豎直放置待用。
2. 按照包埋劑與丙酮體積比3：7配制30%滲透劑，快速吸棄樣品管中純丙酮并加入滲透劑，輕搖滲透3 h。
3. 按照包埋劑與丙酮體積比7：3配制70%滲透劑，快速換液，輕搖滲透過(guò)夜。
4. 重新配制包埋劑，并小心推按注射器，將包埋劑擠到包埋模具中至液面略凸。
5. 解剖針挑取樣品到純包埋劑中，滲透3 h。
6. 小心挑取樣品，濾紙上稍微沾下吸棄部分粘附的包埋劑，輕輕放置到未滲透過(guò)樣品的包埋孔中，小心將樣品按到底，擺放好位置。記錄各樣品對(duì)應(yīng)包埋塊編號(hào)。
7. 梯度溫度聚合包埋
1) 37℃烘箱中12 h，期間定時(shí)觀察樣品有無(wú)漂移現(xiàn)象，如有，則再次小心擺放樣品位置。
2) 45℃烘箱中12 h。
3) 60℃烘箱中24 h。

四、 修塊與切片

1. 拿到包埋塊后檢查樣品位置是否得當(dāng)，選取位置好的包埋塊優(yōu)先進(jìn)行修塊、切片。
2. 粗修包埋塊
1) 使用六角扳手將包埋塊固定在樣品頭上，露出長(zhǎng)度合適。
2) 將樣品頭固定在修塊機(jī)上，體視鏡觀察修塊，分四個(gè)方向?qū)駢K頭部多余的包埋劑修去，暴露出組織塊。
3) 使用鋒利的單面刀片修去組織塊周圍毛刺的包埋劑，使其四邊光滑清晰。
4) 卸下樣品頭裝至切片機(jī)上，使用玻璃刀修片，直至樣品表面光滑清晰。
3. 半薄切片
1) 將粘有水槽的玻璃刀裝至切片機(jī)刀臺(tái)上，體視鏡下小心對(duì)刀，不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)手輪，使樣品上下移動(dòng)，調(diào)整刀臺(tái)左右角度及樣品上下角度，直至包埋塊整個(gè)表面與刀刃的距離相等。
2) 轉(zhuǎn)動(dòng)手輪，使整個(gè)樣品高于刀刃，點(diǎn)控制面板Start，設(shè)置切片區(qū)域上邊界；轉(zhuǎn)動(dòng)手輪，使整個(gè)樣品低于刀刃，點(diǎn)控制面板End，設(shè)置切片區(qū)域下邊界。
3) 手動(dòng)步進(jìn)刀臺(tái)靠近樣品，至出現(xiàn)彩色干涉光，繼續(xù)步進(jìn)刀臺(tái)，并通過(guò)體視鏡觀察干涉光譜變化，直至干涉光消失。
4) 轉(zhuǎn)動(dòng)手輪，使樣品離開刀刃區(qū)域，使用滴管將干凈的去離子水加到玻璃刀水槽中，體視鏡觀察直至液面略低于刀刃。
5) 調(diào)整切片厚度與速度，按控制面板Run/Stop鍵，開始切片。體視鏡觀察可見(jiàn)900nm厚度切片反光為亮綠色。
6) 待有切片下來(lái)形成4-6片的切片帶，按Run/Stop鍵停止切片，體視鏡觀察下，使用睫毛筆將所需薄片撥離刀刃，并將所需切片聚攏一起。
7) 用干凈撈片環(huán)輕輕沾取切片所在區(qū)域，根據(jù)水膜表面張力撈取切片，放到干凈載玻片上，酒精燈略微加熱，使水蒸干，并對(duì)著光亮用記號(hào)筆標(biāo)示切片所在位置。
4. 半薄切片染色
1) 吸取20μL甲苯胺藍(lán)染液，滴加到載玻片放有切片的位置，室溫靜置30 s 。
2) 去離子水沖洗玻片，直至不再有藍(lán)色。吸水紙上瀝干，酒精燈略微加熱，加速切片上的水分蒸發(fā)。
3) 顯微鏡觀察切片質(zhì)量和樣品位置。
5. 精修包埋塊
1) 移去裝有水槽的玻璃刀，取下裝有包埋塊的樣品頭，裝至修塊機(jī)上。
2) 根據(jù)半薄切片結(jié)果，使用新的鋒利刀口，小心修理包埋塊四邊，使其盡可能的光滑、平整。
6. 超薄切片
1) 將鉆石刀裝至切片機(jī)刀臺(tái)上，體視鏡下小心對(duì)刀，不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)手輪，使樣品上下移動(dòng)，調(diào)整刀臺(tái)左右角度及樣品上下角度，直至包埋塊整個(gè)表面與刀刃的距離相等。
2) 轉(zhuǎn)動(dòng)手輪，使整個(gè)樣品高于刀刃，點(diǎn)控制面板Start，設(shè)置切片區(qū)域上邊界；轉(zhuǎn)動(dòng)手輪，使整個(gè)樣品低于刀刃，點(diǎn)控制面板End，設(shè)置切片區(qū)域下邊界。
3) 手動(dòng)步進(jìn)刀臺(tái)靠近樣品，至出現(xiàn)彩色干涉光，轉(zhuǎn)動(dòng)手輪，使樣品上下移動(dòng)，調(diào)整刀臺(tái)左右角度及樣品上下角度，直至包埋塊整個(gè)表面與刀刃的干涉光譜顏色一致；繼續(xù)步進(jìn)刀臺(tái)，并通過(guò)體視鏡觀察干涉光譜變化，直至干涉光消失。
4) 轉(zhuǎn)動(dòng)手輪，使樣品離開刀刃區(qū)域，使用滴管將干凈的去離子水加到玻璃刀水槽中，體視鏡觀察直至液面略低于刀刃。
5) 調(diào)整切片厚度與速度，按控制面板Run/Stop鍵，開始切片。體視鏡觀察可見(jiàn)70nm厚度切片反光為亮灰色及淺灰色。
6) 待有切片下來(lái)形成10-20片的切片帶，按Run/Stop鍵停止切片，體視鏡觀察下，使用睫毛筆將所需薄片撥離刀刃，并將所需切片聚攏一起。
7) 用干凈撈片環(huán)輕輕沾取切片所在區(qū)域，根據(jù)水膜表面張力撈取切片，輕輕放到干凈載膜銅網(wǎng)上，用尖角濾紙靠近銅網(wǎng)邊緣緩慢吸干水分。
8) 輕輕移去撈片環(huán)，將載有切片的銅網(wǎng)放到鋪有濾紙的平皿中，晾干待染色觀察。

五、 染色

1. 醋酸雙氧鈾染色
1) 按每片載網(wǎng)20μL染液的量吸取醋酸雙氧鈾染液，13 200 rpm離心5 min。
2) 將放有切片的載網(wǎng)小心放到染色盤上，有切片面靠上，并稍微用鑷子按載網(wǎng)邊緣，使其與染色盤接觸粘附牢固。
3) 吸取20μL染液滴加到載網(wǎng)上面，蓋上平皿防塵，室溫染色30 min。
4) 將染色盤整個(gè)放到裝有去離子水的清洗缸中，輕搖清洗1 min。
5) 小心取出染色盤，更換水洗液，輕搖清洗5min。
6) 重復(fù)清洗2次。
2. 檸檬酸鉛染色
1) 按每片載網(wǎng)20μL染液的量吸取醋酸雙氧鈾染液，13 200 rpm離心5 min。④
2) 在放置染色盤的平皿中放入2片固體NaOH，用以吸收平皿中CO2氣體。
3) 吸取20μL染液滴加到載網(wǎng)上面，蓋上平皿防塵，室溫染色8 min。
4) 將染色盤整個(gè)放到裝有去離子水的清洗缸中，輕搖清洗1 min。
5) 小心取出染色盤，更換水洗液，輕搖清洗5min。
連續(xù)染色時(shí)，載網(wǎng)不需要從染色盤上拿下，清洗后直接進(jìn)行鉛染即可，但是鉛染液要現(xiàn)用現(xiàn)取。
6) 重復(fù)清洗2次。
7) 小心夾取載網(wǎng)，放置到鋪有濾紙的干凈平皿中，晾干待電鏡觀察。

六、 電鏡觀察

1. 取出樣品桿，打開樣品夾，小心放入載網(wǎng)，合上樣品夾，并轉(zhuǎn)動(dòng)樣品桿，輕敲確保樣品夾已準(zhǔn)確固定載網(wǎng)。
2. 將樣品桿插入透射電鏡樣品室，開始抽氣。
3. 打開燈絲開關(guān)，等待檢測(cè)電流出現(xiàn)后，打開觀察窗開始觀察。
4. 先在低倍下找到切片，再高倍觀察切片，尋找待看目標(biāo)，仔細(xì)對(duì)焦。
5. 將切片目標(biāo)區(qū)域遇到觀察窗中間后，調(diào)整燈絲電流密度為3.8 pA/cm2。
6. 插入拍照CCD，Start View，微調(diào)焦距，Start Acquire 拍照。
7. 拍照完畢，按格式需求保存照片到指定文件夾。
8. 使用專用寫保護(hù)閃存盤拷貝數(shù)據(jù)到公共電腦觀察、使用。