“國家微生物組計(jì)劃”是奧巴馬政府繼腦計(jì)劃、精確醫(yī)學(xué)、抗癌“登月”之后推出的又一個(gè)重大國家科研計(jì)劃，無疑為目前火熱的微生物組研究又加了一把火。但這一項(xiàng)目想要順利開展并不容易，微生物的數(shù)量龐大，種類繁多，要進(jìn)行分析難上加難，那么真正的新技術(shù)在哪里呢？
——美國白宮宣布啟動(dòng)“國家微生物組計(jì)劃”，研究地球上的多種微生物菌群 ?生物通報(bào)道：2007年底美國NIH投入1.15億美元啟動(dòng)了“人類微生物組計(jì)劃”； ?2012-2014年間，聯(lián)邦政府對(duì)微生物組學(xué)的研究資助大增，2014財(cái)年的聯(lián)邦投資是2012財(cái)年的3倍，在3年間的總投資超過9.22億美元；
時(shí)間又來到了2016年5月13日，美國白宮宣布啟動(dòng)“國家微生物組計(jì)劃”，計(jì)劃在財(cái)政年度2016-2017間準(zhǔn)備投入1.21億，其中包括來自美國NIH的2000萬資助，美國國家科學(xué)基金會(huì) (NSF)1600萬資助，NASA的1250萬資助，美國能源部的1000萬資助，以及美國農(nóng)業(yè)部的2390萬美元的資助。這一項(xiàng)目目的在于通過分析人體內(nèi)外，植物和其它生態(tài)系統(tǒng)中微生物，更好的了解這些生物在人體和環(huán)境健康中扮演的重要角色。 ?“這對(duì)于該領(lǐng)域的研究人員來說，是一個(gè)值得慶祝的偉大日子”，科學(xué)大咖J. Craig Venter（J. Craig Venter研究所創(chuàng)始人）對(duì)此表示。J. Craig Venter研究所早在2004年就發(fā)表了關(guān)于馬尾藻的基因組研究。目前，他的研究組已在全球收集了數(shù)千份海洋資源的樣本。
相比于其它項(xiàng)目“緊巴巴”的資金資助，微生物組近年來可謂是“風(fēng)生水起”，在奧巴馬政府繼腦計(jì)劃、精確醫(yī)學(xué)、抗癌“登月”之后推出的這一重大國家科研計(jì)劃無疑為目前火熱的微生物組研究又加了一把火。
這也就可以解釋了為何去年上半年，湯森路透統(tǒng)計(jì)的最高引用的熱門論文出自微生物組研究領(lǐng)域盤點(diǎn)2015上半年最熱門生物類論文，而且這種研究界的這種熱情也感染了公眾，紐約時(shí)報(bào)都曾以頭條宣告“We Are Our Bacteria”。
在這十年里，科學(xué)家們對(duì)于人體微生物的了解逐漸加深，對(duì)人體微生態(tài)的多樣性和分布也認(rèn)識(shí)不少了，但是我們對(duì)于微生物組如何與宿主交互，環(huán)境微生物的影響等微生物組生物學(xué)仍然知之甚少。
這也就是這一新項(xiàng)目啟動(dòng)的主要原因，目前“國家微生物組計(jì)劃”有三大目標(biāo)：首先，支持跨學(xué)科研究，以回答多樣化生態(tài)系統(tǒng)中微生物組的基本問題，如什么是健康的微生物組；其次，開發(fā)檢測(cè)、分析微生物組的工具，如實(shí)時(shí)檢測(cè)空氣、土壤、水或人體微生物的手持傳感器；第三，培訓(xùn)更多的微生物組相關(guān)工作人員。
但這一項(xiàng)目想要順利開展并不容易，首先雖然有顯微成像，低成本高通量基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以及多種數(shù)據(jù)分析的生物信息學(xué)工具躍進(jìn)，但是微生物的數(shù)量龐大，種類繁多，尤其是土壤，海洋和大氣中的微生物群落，收集分析并不容易，一般來說在微生物組樣品中，宿主DNA占了絕大部分，有時(shí)甚至高達(dá)99%。 在實(shí)際樣品中，微生物組DNA往往跟我們不想測(cè)序的東西裹在一起。
那么如何很解決這些問題，微生物組學(xué)真正的新技術(shù)在哪里呢？
樣品收集與保存
來自芝加哥大學(xué)的微生物生態(tài)學(xué)家 Jack Gilbert曾表示，“微生物多樣化多到可怕，而且復(fù)雜。任何特殊處理都會(huì)改變其組成部分?！奔词故俏⑸锞鹤钚〉淖兓蛘呦鄬?duì)豐度改變，也會(huì)極大的干擾群體比對(duì)，因此樣品收集和儲(chǔ)存方法引起的變化越小越好。
原始樣品的保真性從收集樣品的那一刻就開始了。第一步需要確保的是獲得的是一個(gè)均勻的樣品，2015年，一組研究人員完成了一項(xiàng)人腸道微生物組的研究，他們將液氮糞便樣品通過研缽及研杵搗碎，使之成為粉末狀小樣品，然后轉(zhuǎn)移到試管中，?80°C儲(chǔ)存。比較于之前的方法，這種制備樣品的方法能減少微生物組成上出現(xiàn)的可變性。
而土壤樣品具有更加復(fù)雜的組分，因此科學(xué)家們建議將土壤樣品放到攪拌機(jī)中，充分?jǐn)囁轭w粒物。他們也建議在初次收集樣品后再進(jìn)行多次等分分裝，因?yàn)槎啻畏磸?fù)凍融會(huì)破壞核酸，這一點(diǎn)其實(shí)很多實(shí)驗(yàn)室研究人員都知道。比如研究人員可以采用無菌一次性活檢鉗（biopsy punch）從一個(gè)更大的原始樣品中收集幾乎相同大小的凍存糞便顆粒，然后直接將這些顆粒放入含有核酸裂解液中的提取管中。這種方法就是對(duì)原始樣品進(jìn)行等分，但可以為科學(xué)家們節(jié)約整整一次凍融重復(fù)循環(huán)。
此外，2014年，美國福賽思研究所、麻省綜合醫(yī)院（MGH）和哈佛大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院等處的科學(xué)家，開發(fā)出一種新的方法，收集用于基因組和轉(zhuǎn)錄組分析的唾液與糞便。該方法不需要專業(yè)人員和設(shè)施，同時(shí)還能保持樣品的完整性。
研究人員設(shè)計(jì)了固定劑的選擇和取樣流程（如下圖）?？勺?名受試者在家里收集微生物樣品，然后將其運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行多種類型的分子分析。盡管采用不同的取樣方法，微生物種類、基因和基因轉(zhuǎn)錄組成，在所有樣品中都是一致的。隨后對(duì)這些樣品進(jìn)行的分析表明，測(cè)量的人類微生物組的功能潛力和功能活性之間存在著有趣的異同點(diǎn)。在這項(xiàng)研究中是目前為止，結(jié)合表型分類學(xué)、宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)譜，進(jìn)行的第一個(gè)人類微生物組研究。結(jié)果詳細(xì)描述了腸道菌群基因組潛能和基因表達(dá)之間的關(guān)系，驗(yàn)證了在受試者收集和運(yùn)輸?shù)臉悠分虚_展宏轉(zhuǎn)錄組研究的可行性。
RNAlater最初是作為一種RNA保存劑，由Qiagen和Thermo Fisher等廠家開發(fā)出來的（前者當(dāng)?shù)貎r(jià)格為：50mL的78美元，250mL的324美元；后者當(dāng)?shù)貎r(jià)格為100mL的125美元，500mL的386美元），現(xiàn)在可以用于保存DNA。
RNAlater是特殊的樣品儲(chǔ)存液，只要在采樣后立即將新鮮樣品浸入這種液體試劑，RNlater可以迅速滲透到組織或其他生物樣本中，穩(wěn)定并保護(hù)RNA完整而不被降解，確保下游分析得到的數(shù)據(jù)真實(shí)反應(yīng)樣品的表達(dá)信息。
人類微生物組計(jì)劃(Human Microbiome Project)的參與研究人員，來自哈佛大學(xué)的計(jì)算生物學(xué)家Curtis Huttenhower與他的同事們發(fā)現(xiàn)在樣品收集后，如果沒有冰箱，那么可以加入這種保護(hù)劑使用。
不過一些用戶也報(bào)告了RNAlater的缺陷，雖然RNAlater不可燃，因此可以用于樣品運(yùn)輸，但是這種保護(hù)劑會(huì)降低Bacteroidetes 和 Ruminococcaceae 兩種細(xì)菌新鮮提取后的菌群數(shù)量。另外就是如果想獲得樣品高RNA產(chǎn)量，那么就必須先將其去除。Ganz表示，“RNAlater會(huì)妨礙樣品正常形成顆粒沉淀，因此在去除RNAlater之后，還必須磷酸鹽緩沖液進(jìn)行清洗。”
此外，Woods Hole海洋研究所海洋生物化學(xué)家Mak Saito也指出，RNAlater還有一個(gè)問題，那就是其高鹽含量，因此在一些實(shí)驗(yàn)中會(huì)令樣品清洗成為問題。Saito曾采用這種溶液保存海洋微生物組中的蛋白組成。
對(duì)于一些類型的實(shí)驗(yàn)樣品來說，如果加入低溫凍存保護(hù)劑就會(huì)大幅度改變微生物組成，這樣做劃不來，比如土壤樣品。而對(duì)糞便樣品而言，有時(shí)低溫凍存也許并不合適，比如說，用于治療艱難梭菌感染的樣品能在室溫下保存長達(dá)6個(gè)小時(shí)，而且還不會(huì)引起治療療效發(fā)生顯著變化。
測(cè)序技術(shù)
高通量基因測(cè)序技術(shù)無疑是微生物組研究的一大依靠，但是對(duì)于紛繁復(fù)雜的微生物組來說，測(cè)序技術(shù)工具還需不斷的開發(fā)改進(jìn)，去年年底，斯坦福大學(xué)的研究人員首次開發(fā)出了一種新測(cè)序技術(shù)，用于分析人類腸道微生物組，克服了短讀取測(cè)序的技術(shù)限制。
他們將Illumina長讀取技術(shù)（TruSeq Synthetic Long-Reads）與計(jì)算工具結(jié)合起來，克服了短讀取測(cè)序的技術(shù)限制，獲得了一名男性腸道微生物組的清晰圖譜。
目前通常是通過短讀取測(cè)序獲得一小段一小段的信息，為了改善這一問題，研究人員采用新方法，將較大的基因組片段裝訂在一起。首先用復(fù)雜的算法先將小片段組裝成10,000-base片段，再將10,000-base片段組裝成更長的片段，然后拼出整個(gè)基因組。研究指出，將Illumina長讀取技術(shù)與短讀取測(cè)序相結(jié)合，能夠更加精確和全面的分析宏基因組樣本，更容易在人、動(dòng)物、植物、水和土壤中建立致病菌菌株的進(jìn)化史。
但是目前一些科學(xué)家也提出，DNA提取試劑盒、化學(xué)試劑和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的雜菌很容易造成污染，影響微生物組分析的結(jié)果。 ?研究人員發(fā)現(xiàn)，沒有污染的話對(duì)照樣本應(yīng)該只有一種菌，但有時(shí)卻出現(xiàn)了270種不同的細(xì)菌。與高生物量的樣本相比（糞便樣本），來自血液或肺部的低生物量樣本尤其容易受到污染。
為此，研究人員建議研究者們?cè)谘芯康蜕锪繕颖緯r(shí)采取一些額外的步驟。比如使用陰性對(duì)照鑒定可能污染樣本的雜菌，進(jìn)行過濾或富集以增大初始材料中的生物量，在樣本收集的時(shí)候盡量降低污染的可能。
信息分析工具
在分離和測(cè)序細(xì)菌核酸之后，我們需要從數(shù)據(jù)中提取有效的信息，這并不是一件容易的事兒。微生物組研究者一般有兩個(gè)選擇：16S rDNA測(cè)序和宏基因組測(cè)序。16S rDNA測(cè)序可以展現(xiàn)樣本中的微生物種類和豐度，反映微生物多樣性的大規(guī)模改變。而宏基因組測(cè)序可以揭示微生物群體的代謝潛能，幫助人們組裝不同微生物的基因組。
16S rRNA分析最常用的工具是開源的QIIME和Mothur。當(dāng)然市面上也有商業(yè)化的程序包，比如Thermo Fisher公司的Ion 16S Metagenomics Kit。這是一個(gè)基于網(wǎng)頁和云端的免費(fèi)程序包。過去的微生物組研究主要使用16S rDNA測(cè)序。隨著測(cè)序成本的直線下降，針對(duì)整個(gè)菌群的宏基因組測(cè)序越來越受到青睞，因?yàn)檫@一技術(shù)能夠提供更全面的基因組和功能信息。
哈佛大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院的Eric Franzosa為宏基因組數(shù)據(jù)分析開發(fā)了HUMAnN2。第一代HUMAnN主要是根據(jù)宏基因組或者宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析微生物通路在群體中是否存在。也就是說，給HUMAnN提供微生物群落的DNA或RNA序列，它就會(huì)告訴你這個(gè)群體能夠執(zhí)行什么樣的分子功能。HUMAnN2在HUMAnN的基礎(chǔ)上進(jìn)行了拓展，將微生物與特定活性關(guān)聯(lián)起來。
MetaPath也是一個(gè)用于宏基因組數(shù)據(jù)分析的重要工具。該工具由馬里蘭大學(xué)的副教授Mihai Pop開發(fā)，可以根據(jù)宏基因組數(shù)據(jù)分析特定群體在不同條件下的代謝變化。舉例來說，Pop的研究團(tuán)隊(duì)對(duì)胖人和瘦人進(jìn)行微生物組研究，通過MetaPath鑒定了脂肪酸生物合成通路的差異。
宏基因組研究通常是從環(huán)境中收集微生物和病毒樣品，然后將這些樣本破碎，把它們的基因組DNA降解成片段，最后通過測(cè)序儀進(jìn)行分析。宏基因組分析比一般的基因組分析需要更多的借助計(jì)算機(jī)技術(shù)，因?yàn)楹昊蚪M分析處理的是不同基因組的混合物，而不是單純的同質(zhì)微生物種群。宏基因組分析產(chǎn)生的數(shù)據(jù)比一般基因組分析多得多，這是這一研究領(lǐng)域面臨的一大挑戰(zhàn)。
常用的一些工具，如MEGAN5主要用于MEtaGenome ANalyzer，最初是在2007年開發(fā)出來，用于識(shí)別長毛猛犸象骨中DNA測(cè)序研究的微生物污染。MEGAN5是發(fā)布的最新版本，除了可以幫助進(jìn)行分類分析，也可以快速比較多個(gè)數(shù)據(jù)集，區(qū)分宏基因組中基因的功能，此外還提供元數(shù)據(jù)metadata支持和數(shù)據(jù)可視化的新途徑。
此外，近期Nature Methods雜志發(fā)布了一個(gè)名為TruSPADES的強(qiáng)大工具，可以大大提升研究者們測(cè)序宏基因組的能力。這種算法能將Illumina測(cè)序儀生成的300bp短讀取，合并成大約1萬bp的基因組片段（Synthetic Long Reads）。如果說用短讀取相當(dāng)于語句，那么長片段就是整章文字。顯而易見，把整章文字還原成一本書要容易得多。
TruSPADES主要是先給100-300bp的短讀取裝上條碼，然后通過de brujin 圖把這些片段組裝起來，生成Synthetic Long Reads。這種低成本的方法可以更好的確定相連片段，獲得更長更準(zhǔn)確的長測(cè)序片段。
題外話：
雖然微生物組熱潮鋪天蓋地，但是一些科學(xué)家認(rèn)為這其實(shí)掩蓋了其中的風(fēng)險(xiǎn)?；仡欀暗姆N種“組學(xué)”熱我們可以看到，技術(shù)進(jìn)步賦予了人們分析基因組、蛋白質(zhì)組、代謝組的能力，于是便有大量研究將這些分子的狀態(tài)與人體健康聯(lián)系起來。然而，這些研究的后續(xù)工作往往后繼無力，情況反而越來越復(fù)雜。
此前Nature雜志曾經(jīng)刊文，對(duì)微生物組熱潮進(jìn)行了反思。文章指出，在接受一項(xiàng)新結(jié)論之前，我們應(yīng)該首先提出五個(gè)問題：
研究有沒有檢測(cè)到有意義的差異？
微生物組圖譜主要依賴16S rRNA分析，能提供門、屬、種的信息，但這種分類還不夠細(xì)。舉例來說，有研究鑒定了與糖尿病有關(guān)的微生物組，是細(xì)菌不同門之間呈特定比例，這未免太過于寬泛。這相當(dāng)于是認(rèn)為100只鳥和25只蝸牛組成的鳥舍等同于有8條魚和2只烏賊的水箱，只因?yàn)轼B舍和水箱里的脊椎動(dòng)物和軟體動(dòng)物之比都是4:1。另外，就算是同一個(gè)屬的微生物，所含基因也往往大相徑庭。
如今的技術(shù)其實(shí)可以做到更細(xì)致的分類，我們可以通過破譯“代謝網(wǎng)絡(luò)”來理解微生物組進(jìn)行的生化反應(yīng)，并在此基礎(chǔ)上鑒定對(duì)健康有影響的基因組合。不過這就要求研究者對(duì)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)有一個(gè)透徹的了解。
研究是否明確了因果關(guān)系？
在鑒定疾病相關(guān)微生物組時(shí)，我們需要確定這種關(guān)系到底是不是因果關(guān)系，因?yàn)檫@種特別的微生物組有時(shí)可能只是個(gè)副產(chǎn)物。
2012年有一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，住在養(yǎng)老院里的老人微生物組與住在社區(qū)里的老人不同，而且這種差異與體質(zhì)強(qiáng)弱。作者在考慮了多種因素后指出，飲食能夠改變微生物組進(jìn)而影響健康狀況。這種結(jié)論的確與數(shù)據(jù)相符，但研究者卻沒能反向證明這樣的因果關(guān)系。因?yàn)榭赡苡绊懳⑸锝M的因素很多，比如免疫系統(tǒng)比較不活躍，消化能力較弱等等。
作用機(jī)制是什么？
我們都知道，相關(guān)性并不等同于因果關(guān)系。不過存在相關(guān)性，多半意味著某種因果關(guān)系的存在，這需要我們努力去發(fā)掘。
現(xiàn)在，研究者們可以通過設(shè)計(jì)，精確限定微生物組中的成分，建立缺乏某一類微生物的菌群，或者利用“芯片上的器官”測(cè)定微生物組的生化活性。這樣的方法能夠幫助我們確定，某一種微生物組對(duì)人體健康的影響。
研究是否足以反映真實(shí)情況？
不過，就算微生物組在實(shí)驗(yàn)中能夠影響健康，也可能并不是造成患者癥狀的主要原因。
舉例來說，微生物組研究往往使用無菌小鼠，以便引入實(shí)驗(yàn)性的菌群。但是這些小鼠并不能代表動(dòng)物的天然狀態(tài)，缺乏微生物組的它們其實(shí)并不健康。因此，實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不一定符合動(dòng)物的天然應(yīng)答。另外，小鼠的生活環(huán)境與人類差異很大，有關(guān)微生物組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也許并不能很好的用于人類。
結(jié)果是否可能有別的解釋？我們有充分的理由相信，細(xì)菌正在通過多種途徑對(duì)我們施加影響。但是也有許多其他因素（可能更重要）在起作用，比如飲食。在把某種微生物組與疾病關(guān)聯(lián)起來之前，明智的做法是，把所有可能的因素都納入考慮。
參考文獻(xiàn)：
Methods for Improving Human Gut Microbiome Data by Reducing Variability through Sample Processing and Storage of Stool
Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut
Examination of Microbial Proteome Preservation Techniques Applicable to Autonomous Environmental Sample Collection
TruSPAdes: barcode assembly of TruSeq synthetic long reads
Synthetic long-read sequencing reveals intraspecies diversity in the human microbiome
Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses