乙醇是生產(chǎn)規(guī)模最大、應(yīng)用程度最高的可再生生物液體燃料。現(xiàn)階段，生物乙醇的主要來源是采用含糖量豐富的農(nóng)業(yè)生物質(zhì)為原料的生物煉制過程，以“玉米乙醇”最具代表性，然而其“與糧爭地、與人爭糧”的原料供應(yīng)模式引發(fā)了極大的社會爭議；以木質(zhì)纖維素等農(nóng)業(yè)、林業(yè)廢棄物為原料的纖維素乙醇合成技術(shù)緩解了“糧食乙醇”在原料供應(yīng)上的不足，但是纖維素原料的預(yù)處理及酶解糖化過程需要消耗大量能量、水和纖維素酶，從而極大地拉高了生產(chǎn)成本。與生物煉制過程相比，通過光合微生物平臺將二氧化碳和太陽能直接轉(zhuǎn)化為乙醇的技術(shù)路線（CO2 To Ethanol, CTE）減少了原材料預(yù)處理、底物提煉過程的損耗，也節(jié)省了對淡水和用地的需求，在經(jīng)濟性與可持續(xù)性上表現(xiàn)出更大的潛力與優(yōu)勢。
中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所微生物代謝工程團隊在藍細菌光合生物合成乙醇技術(shù)方面取得了系列研究進展。該團隊以重要的模式藍細菌集胞藻PCC6803（Synechocystis sp. PCC6803）為底盤藻株，將來自運動發(fā)酵單胞菌的PdcZM-AdhIIZM（丙酮酸脫羧酶-II型醇脫氫酶）途徑導(dǎo)入PCC6803，打通了乙醇光合合成路線，實現(xiàn)了工程藻株中乙醇的合成與分泌；針對藍細菌生理和代謝背景特性分析，使用來自集胞藻PCC6803自身的NADPH依賴型的II型醇脫氫酶基因slr1192替換AdhIIZM后，成功地優(yōu)化了乙醇合成途徑與底盤藻株的適配性，使乙醇產(chǎn)量提高了50%；在此基礎(chǔ)上結(jié)合競爭性途徑敲除和代謝途徑拷貝數(shù)強化等策略，最終獲得了具有較強乙醇光合合成能力的工程藻株Syn-HZ24，在柱式反應(yīng)器中經(jīng)過28天培養(yǎng)后，乙醇產(chǎn)量達到5.5g/L，合成速率0.2g/L/day，處于國際領(lǐng)先水平。上述結(jié)果奠定了該團隊在藍細菌乙醇方向上的研究基礎(chǔ)，已經(jīng)發(fā)表于《能源與環(huán)境科學(xué)》（Energy & Environmental Science，Gao, et al, 2012, 5:9857–9865）。
為了進一步提升藍細菌工程藻株乙醇光合合成的潛力，該團隊采用體外重構(gòu)和動態(tài)分析的策略對新發(fā)展的PdcZM-slr1192途徑的催化特性進行了深入挖掘。首先脫離復(fù)雜的胞內(nèi)環(huán)境在胞外重新構(gòu)建該途徑，以純化后的酶（PdcZM/slr1192）、底物（丙酮酸，Pyruvate）、輔因子（NADPH/NADH/TPP）、金屬離子（Mg2+）以及中間產(chǎn)物（乙醛，acetaldehyde）對整個途徑的催化效率影響分別進行定量的滴定分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)影響乙醇合成的限制因素是PdcZM而非slr1192；在總蛋白濃度設(shè)置恒定的條件下，PdcZM-slr1192的濃度比為4:6時，全途徑具有最大的乙醇合成催化活性。為了驗證Cell free條件下獲得的結(jié)果，研究人員在集胞藻PCC6803中構(gòu)建了PdcZM-slr1192濃度配比不同的工程菌株，通過代謝工程結(jié)合酶活與蛋白含量分析實驗，證實了現(xiàn)有工程藻株中PdcZM的表達量和活性是乙醇合成能力的首要限制因素。此外，體外重構(gòu)體系中的滴定數(shù)據(jù)結(jié)合藍細菌胞內(nèi)代謝物的實際含量分析還顯示，提高NADPH和丙酮酸的供應(yīng)量也應(yīng)該是提高乙醇合成效率的重要選擇。上述結(jié)果明確了藍細菌乙醇光合工程藻株進一步改造的方向，已經(jīng)發(fā)表于生物能源期刊Biotechnology for Biofuels（Luan, et al, 2015, 8:184）。
基于已經(jīng)開發(fā)的藍細菌乙醇光合工程藻株，該團隊又進一步探索了光合細胞工廠的擴大化培養(yǎng)技術(shù)。光合生物制造通常在戶外、開放式、未滅菌的條件下進行，因此經(jīng)常面臨各種模式的生物污染的嚴重威脅進而導(dǎo)致擴大培養(yǎng)的失敗。研究人員在進行工程藻株Syn-HZ24的開放式、規(guī)模化培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，其乙醇合成與積累過程受到了微生物污染的嚴重影響。通過分析和鑒定，確定了Pannonibacter phragmitetus為乙醇光合合成的主要威脅來源，該菌可以以乙醇為唯一碳源進行生長，迅速消耗工程藻株合成的乙醇并在培養(yǎng)體系中大量增殖。通過對Pannonibacter phragmitetus和Syn-HZ24的生理和生化分析，研究人員提出提高培養(yǎng)體系pH值來抑制Pannonibacter phragmitetus侵染并恢復(fù)乙醇光合合成的設(shè)想（Bicarbonate-based Integrated Carbon Capture System, BICCS），并在實驗室柱式反應(yīng)器和戶外薄膜掛袋兩種體系下進行了驗證，結(jié)果表明該策略可以有效解決Syn-HZ24在開放式培養(yǎng)過程中的生物污染問題，在規(guī)模化培養(yǎng)9天后乙醇產(chǎn)量達到0.9g/L，而常規(guī)pH條件下的對照體系中無乙醇積累。此部分工作鑒定了一種工程藍細菌規(guī)?；囵B(yǎng)過程中新的生物污染模式，并針對性地設(shè)計、驗證了解決方案，對光合細胞工廠培養(yǎng)的工程化、規(guī)?；l(fā)展有普遍的借鑒意義。該工作近期發(fā)表于Biotechnology for Biofuels（Zhu, et al, 2017, 10:93）。
上述研究獲得國家自然科學(xué)基金、“863”計劃、山東省泰山學(xué)者項目、山東省自然科學(xué)基金以及青島市創(chuàng)新領(lǐng)軍人才項目的支持。
