微藻營養(yǎng)豐富，是魚、蝦、貝等經(jīng)濟動物人工育苗的基礎(chǔ)。特別是海洋微藻，由于富含EPA和DHA，在許多方面受到人們的青睞。在微藻的培養(yǎng)和應(yīng)用中，保種技術(shù)十分重要，它是微藻培養(yǎng)和進(jìn)一步應(yīng)用的基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于藻種極易受污染，分離培養(yǎng)方法比較復(fù)雜而且耗時較長，因此，在微藻保種工作中要盡量減少接種次數(shù)，避免藻種被雜藻、細(xì)菌或原生動物污染，既能達(dá)到長期貯藏種質(zhì)的目的，又能維持藻種的活性，是微藻科研工作者努力的方向之一。本文就微藻保存的幾種常用方法介紹如下。

一、繼代法保存

繼代保存法是目前普遍采用的方法，使用于一切藻種的保存。通常在常溫或常低溫進(jìn)行。常溫一般指15℃～25℃，常低溫一般指0℃～15℃，藻種可接種在固體、液體或雙相培養(yǎng)基中。接種后應(yīng)首先放在適宜的光照條件下培養(yǎng)，待藻細(xì)胞生長繁殖達(dá)到較高密度，可見明顯的條狀或塊狀的藻細(xì)胞群時，再移置低溫、弱光的條件下保藏。保藏半年到1年后必須進(jìn)行轉(zhuǎn)接。此方法簡單易行，但是保存時間短，而且繼代頻繁，容易發(fā)生污染和變異。

二、固定化保存法

固定化細(xì)胞（1mmobilized cells）是指將游離細(xì)胞包埋在多糖或多聚化合物制成的網(wǎng)狀支持物中，固定載體束縛藻種，影響其代謝過程，從而抑制細(xì)胞的生長和分裂。固定化微生物技術(shù)是在20世紀(jì)60年代固定化酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，1978年以來，固定化技術(shù)就被用來作為延長光合細(xì)胞壽命的一種重要手段。但微藻存活時間從1個月到幾年不等。張繼紅將三角褐脂藻固定在褐藻酸鈣凝膠中，可保存3～5年；Tamponnet等報道了固定化纖細(xì)裸藻存活2年；矮小海鏈藻（Thalassiosira pseudonana）和賀氏鈣板金藻 （Emiliana hux liyi）僅能保存3個月。近來孟妍等人采用褐藻膠包埋技術(shù)與干燥脫水技術(shù)相結(jié)合將綠色巴夫藻常溫保存，保存時間可達(dá)6個月存活率高達(dá)77.6%。

固定化保種技術(shù)對多數(shù)微藻是適用的，該法可以在常低溫下實現(xiàn)對藻類的中期保存，培養(yǎng)保存時間較長，活化復(fù)蘇快，技術(shù)設(shè)備簡單，細(xì)胞外滲少，而且可用于次生代謝物質(zhì)的生產(chǎn)。在一般的微藻實驗室內(nèi)都能進(jìn)行。但固定化程序較復(fù)雜，大多數(shù)微藻在培養(yǎng)后期常會從膠珠中溢出。而且，現(xiàn)有的資料表明，某種固定化方法只適用一定種類的微藻，對于其他種類的微藻會有不同的反應(yīng)，原因復(fù)雜，還需要做更深入、廣泛的研究。這就給固定化保種技術(shù)的推廣帶來了一定的困難。

三、超低溫保種技術(shù)

所謂超低溫保存區(qū)別于其他低溫概念的冰箱溫度（4℃～～40℃）和干冰溫度（～79℃），是指在液氮低溫（～196℃）下保存。此時生物體的物質(zhì)代謝和生長活動幾乎完全停止?？墒撬鼈?nèi)蕴幱诳赡娴某苫顮顟B(tài)。早在20世紀(jì)70年代，英國的Morris等就對海產(chǎn)單胞藻進(jìn)行了超低溫保存研究，取得了在～196℃下保存1年，存活率100%的結(jié)果。目前普遍采用兩步冷凍法，即慢速降溫進(jìn)行冷適應(yīng)，然后投入液氮中保存。王起華等用兩步冷凍法研究了3種餌料金藻，其存活率均在30%左右。

超低溫保存法具有保持種質(zhì)遺傳穩(wěn)定性、對藻種進(jìn)行優(yōu)勝劣汰、便于長期保存、能最大限度地減少污染等方面的優(yōu)點，還能省去藻種的活力監(jiān)測和繁殖更新。但微藻的種類很多，生理狀態(tài)各異，適宜的保存條件各不相同，找出不同微藻的超低溫保種方法困難，而且不同的細(xì)胞要求不同類型、不同濃度的抗凍劑， 至今還沒有找出1種對所有種類都適用的保護(hù)劑。但隨著研究的深入，在探明生物細(xì)胞凍害和抗凍機理的基礎(chǔ)上，超低溫保存微藻藻種的應(yīng)用前景將會是十分光明的。

四、濃縮低溫保存技術(shù)

濃縮低溫保存法是將藻液高密度培養(yǎng)后，采用物理、化學(xué)的方法濃縮1000倍左右，再低溫保存。國外自80年代末開始就有對海洋經(jīng)濟微藻的濃縮方法和低溫保存方法進(jìn)行研究，取得了不少的研究成果，其中美國、英國和日本已有相應(yīng)的產(chǎn)品（微藻濃縮細(xì)胞或稱“藻膏”）問世。蔣霞敏等將小球藻和球等鞭金藻301（1sochrysis galbana Park）濃縮后，在5℃～7℃的冰箱中保存1～3個月后恢復(fù)生長獲得好于常溫的效果。孫建華、王如才（1993）對小新月菱形藻（Nitzschia closterium）、球等鞭金藻的濃縮和保存方法進(jìn)行了研究，濃縮藻液在1℃～4℃的低溫下加保護(hù)劑SAMs保存3個月，復(fù)蘇后效果良好。
濃縮低溫保存多用于海洋微藻。微藻濃縮液的生產(chǎn)，可以使海洋微藻的生產(chǎn)與使用保留一定的時間差。但相對保存時間較短，海洋微藻的抗逆原理還有待作更多的研究和探討。

五、冷凍真空干燥保存法

冷凍真空干燥保存法是在極低溫度下（～70℃左右）快速冷凍，然后在極低溫度下真空干燥，使藻種的新陳代謝活動處于高度靜止?fàn)顟B(tài)。19世紀(jì)末Fkral與Mudd創(chuàng)立的冷凍真空干燥法是迄今公認(rèn)最佳的藻種保存法，嚴(yán)珍等選擇脫脂牛奶作為保護(hù)劑，將藻液放入安瓿管中，冷凍、干燥并抽真空，火焰熔封。在低溫避光處保存，預(yù)計最大保存年限為18年。冷凍干燥保存法優(yōu)點是微藻復(fù)蘇效果好，保藏期內(nèi)可避免其他雜菌污染，便于攜帶運輸，易實現(xiàn)商品化生產(chǎn)；其缺點是操作繁瑣、對設(shè)備要求高等；應(yīng)用前景十分光明。

六、低溫甘油生理鹽水法

低溫甘油生理鹽水法是對甘油原液保存法的改進(jìn)。加入生理鹽水適當(dāng)降低了甘油的高滲作用，更有利于藻種的保存。在藻液中人一定的甘油作保護(hù)劑，同時加入一定的生理鹽水，混勻后直接放置在～20℃±0.5℃冰箱放置保存。保存時間長，一般3年左右。
綜上所述，單細(xì)胞藻類的保種技術(shù)尚沒有發(fā)展成為一項成熟穩(wěn)定的技術(shù)，許多問題還有待于我們?nèi)ヌ剿?，開展微藻保種方面的研究工作，不但會填補微藻保種理論研究上的空白，還會在生產(chǎn)實踐中發(fā)揮應(yīng)有的作用。

關(guān)鍵詞:單細(xì)胞藻種,固體培養(yǎng)基,保種

氮源單細(xì)胞(Unicelluler)藻種的保藏一直是制約工廠化育苗生產(chǎn)中單胞藻正常供應(yīng)和長期保存的重要因素。通常采用液體保藏方法，周期短、易污染、保藏條件：難以控制，容易造成藻種保種失敗。

采用固體培養(yǎng)基保藏，可以通過營養(yǎng)成分的緩釋作用，在適宜的條件下延長保藏期2~3年。

但需解決一些關(guān)鍵問題，一是藻種的提純技術(shù)，二是選擇合適的固體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分，否則接種保藏難以取得良好的效果。國內(nèi)有關(guān)固體培養(yǎng)基保藏藻種的實用技術(shù)詳細(xì)報道不是很多，大部分僅作粗略介紹，有些在實際應(yīng)用中效果不理想，如金藻門(Chrysophyta)的球等鞭金藻3010、3011、湛江叉鞭藻、顆石藻以及硅藻門的牟氏角毛藻等，按照資料中介紹以硝酸鈉為氮源、2％瓊脂制成的培養(yǎng)基來培養(yǎng)保存藻種往往失敗。而改用以尿素為氮源，5~6‰瓊脂制成的培養(yǎng)基保種，藻種生長正常并且易提純。

其它綠藻門(Chlorophyta)、硅藻門(Bacillariophyta)、和黃藻門(Xanthophyta)等海洋單細(xì)胞藻種固體培養(yǎng)基保藏方法也可以用此方法。現(xiàn)介紹如下：

1、材料與方法
1.1 儀器設(shè)備：超凈工作臺、Nikon攝影顯微鏡、生化培養(yǎng)箱、電熱蒸汽壓力消毒器、電子天平、電熱爐、無菌封口膜、三角錐形瓶、移液管、酒精燈、接種針等。
1.2?試劑藥品：純化瓊脂粉、尿素、硝酸鈉、磷酸二氫鉀、魯歌氏溶液、檸檬酸鐵、硅酸鈉、碳酸氫鈉、山梨酸鉀、EDTA-Na、VB1、VB12等。
1.3?藻類材料：球等鞭金藻(Isochrysis galbana OA-3011、OA-3010)、湛江等鞭金藻 (Isochrysis zhangjiangensis?Hu&Liu)、Coccolithus藻、綠色巴夫藻(Pavlova viridis?)、牟氏角毛藻(Chaetoceros meülleri?Lemmermann)、異膠藻(Heterogioea sp．)、小球藻Chlorella sp.)、中肋骨條藻(?Skeletonema costatum?Greville)。

1.4?方法：

1.4.1 藻種液的制備：在固體培養(yǎng)基接種前一周將上述單細(xì)胞藻種分別無菌接種，目的是確保固體培養(yǎng)基接種時藻群處于指數(shù)生長期。

1.4.2 固體培養(yǎng)基的制備：固體培養(yǎng)基制備按照下述(1.4.3)培養(yǎng)基營養(yǎng)成分配制培養(yǎng)液，營養(yǎng)成分的加入順序依次為N、P、Fe、Si、VB、NaHC03、山梨酸鉀、EDTA-Na等。每加入一種營養(yǎng)物質(zhì)，?都要攪拌均勻，再加入第二種。最后加入瓊脂，營養(yǎng)液配好后置于可調(diào)溫電熱爐上加熱微融化。趁熱分裝于100ml的三角錐形瓶中，分裝量每瓶約30-40ml左右，三角錐形瓶口采用無菌培養(yǎng)容器封口膜封口。

1.4.3 固體培養(yǎng)基配方：金藻門、綠藻門、硅藻門、黃藻門配方如下：

1.4.4 固體培養(yǎng)基滅菌將分裝好的固體培養(yǎng)基放入高壓滅菌器，壓力15磅，溫度121℃，時間三十分鐘。

1.4.5 接種與培養(yǎng)在超凈工作臺上或酒精燈下，將上述藻液接種至已冷卻固體培養(yǎng)基中，一般采用接種環(huán)刺穿培養(yǎng)基表面劃“之”或“井”字線法，接種完畢的固體培養(yǎng)基置于溫度20-25℃、自然光照(3000-5000lux左右，避免直射光)的環(huán)境條件中培養(yǎng)，約十天，即可發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上有藻落生長。

1.4.6低溫保藏將藻落生長良好的固體培養(yǎng)基置于10℃的低溫培養(yǎng)箱中，自然光照即可。在此條件下，藻種可以保藏2-3年左右。

2．結(jié)果與分析

2.1結(jié)果：在藻種接種后一周，部分藻種的固體培養(yǎng)基內(nèi)藻細(xì)胞逐漸繁殖起來，一個月后，發(fā)現(xiàn)試驗一中綠藻門的小球藻，黃藻門的異膠藻、硅藻門的中肋骨條藻、牟氏角毛藻、金藻門的幾種金藻，藻群群落都能正常生長。試驗二中除金藻門及牟氏角毛藻外，其他藻都能正常生長。

2.2討論
(1)試驗一與試驗二固體培養(yǎng)基中營養(yǎng)成份所不同的足提供氮源的營養(yǎng)鹽不同。試驗一為尿素，試驗二為硝酸鈉，可見不同的氮源在單胞藻保種過程中起著不同的作用。分析原因，是因為球等鞭3010、301l、湛江叉鞭藻、牟氏角毛藻等單細(xì)胞藻具有尿素酶，能分解尿素作氮源，而利用硝酸鈉作氮源，需要將硝態(tài)氮還原成銨態(tài)氮，這幾種藻含有的異養(yǎng)菌較少，又由于處于無菌的環(huán)境中，所以藻種在試驗一中能正常生長，而在試驗二中不能正常生長。

(2)單胞藻的提純：采用固體培養(yǎng)基接種保藏方法，常發(fā)現(xiàn)雜藻藻落存在，可采用接種環(huán)將所需藻種重新接種至預(yù)備固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)保藏，這樣反復(fù)幾次，使藻種得到提純。

(3)瓊脂：在添加瓊脂時不能機械的照搬資料中介紹的2%用量，要根據(jù)瓊脂的質(zhì)量靈活使用，可預(yù)先多做幾組培養(yǎng)基試驗了解瓊脂的特性，不同質(zhì)量的瓊脂所添加的量是不同的，培養(yǎng)基太硬，影響營養(yǎng)鹽的緩釋，水分易失去，不利藻群的生長，培養(yǎng)基太軟又起不到固體低溫保存延長保種時間的目的?？傊?，要具體問題具體分析，有時可根據(jù)保種的需要制成半固體狀態(tài)的培養(yǎng)基，一方面營養(yǎng)鹽緩慢釋放，另一方面，水分含量較高，培養(yǎng)基不易干燥，有利于藻種的保存。

(4)EDTA-Na：EDTA-Na能絡(luò)和海水中的重金屬離子但同時也將單胞藻生長繁殖需要的微量元素絡(luò)和掉了，用量要小，一般不能超過5mg/L。在保種時，固體培養(yǎng)基不使用EDTA-Na藻群也能正常生長。