球等鞭金藻3010、3011、湛江叉鞭藻、顆石藻（Coccolithus）、牟氏角毛藻等單細胞藻種在以硝酸鈉為氮源的固體培養(yǎng)基上不能夠正常生長，在以尿素為氮源的固體培養(yǎng)基上生長良好藻種易提純保種。
作者：陸德祥
關鍵詞:單細胞藻種,固體培養(yǎng)基,保種
氮源單細胞(Unicelluler)藻種的保藏一直是制約工廠化育苗生產(chǎn)中單胞藻正常供應和長期保存的重要因素。通常采用液體保藏方法，周期短、易污染、保藏條件：難以控制，容易造成藻種保種失敗。
采用固體培養(yǎng)基保藏，可以通過營養(yǎng)成分的緩釋作用，在適宜的條件下延長保藏期2~3年。
但需解決一些關鍵問題，一是藻種的提純技術，二是選擇合適的固體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分，否則接種保藏難以取得良好的效果。國內(nèi)有關固體培養(yǎng)基保藏藻種的實用技術詳細報道不是很多，大部分僅作粗略介紹，有些在實際應用中效果不理想，如金藻門(Chrysophyta)的球等鞭金藻3010、3011、湛江叉鞭藻、顆石藻以及硅藻門的牟氏角毛藻等，按照資料中介紹以硝酸鈉為氮源、2％瓊脂制成的培養(yǎng)基來培養(yǎng)保存藻種往往失敗。而改用以尿素為氮源，5~6‰瓊脂制成的培養(yǎng)基保種，藻種生長正常并且易提純。
其它綠藻門(Chlorophyta)、硅藻門(Bacillariophyta)、和黃藻門(Xanthophyta)等海洋單細胞藻種固體培養(yǎng)基保藏方法也可以用此方法?，F(xiàn)介紹如下：
1、材料與方法
1.1 儀器設備：超凈工作臺、Nikon攝影顯微鏡、生化培養(yǎng)箱、電熱蒸汽壓力消毒器、電子天平、電熱爐、無菌封口膜、三角錐形瓶、移液管、酒精燈、接種針等。
1.2?試劑藥品：純化瓊脂粉、尿素、硝酸鈉、磷酸二氫鉀、魯歌氏溶液、檸檬酸鐵、硅酸鈉、碳酸氫鈉、山梨酸鉀、EDTA-Na、VB1、VB12等。
1.3?藻類材料：球等鞭金藻(Isochrysis galbana OA-3011、OA-3010)、湛江等鞭金藻 (Isochrysis zhangjiangensis?Hu&Liu)、Coccolithus藻、綠色巴夫藻(Pavlova viridis?)、牟氏角毛藻(Chaetoceros meülleri?Lemmermann)、異膠藻(Heterogioea sp．)、小球藻Chlorella sp.)、中肋骨條藻(?Skeletonema costatum?Greville)。
1.4?方法：
1.4.1 藻種液的制備：在固體培養(yǎng)基接種前一周將上述單細胞藻種分別無菌接種，目的是確保固體培養(yǎng)基接種時藻群處于指數(shù)生長期。
1.4.2 固體培養(yǎng)基的制備：固體培養(yǎng)基制備按照下述(1.4.3)培養(yǎng)基營養(yǎng)成分配制培養(yǎng)液，營養(yǎng)成分的加入順序依次為N、P、Fe、Si、VB、NaHC03、山梨酸鉀、EDTA-Na等。每加入一種營養(yǎng)物質(zhì)，?都要攪拌均勻，再加入第二種。最后加入瓊脂，營養(yǎng)液配好后置于可調(diào)溫電熱爐上加熱微融化。趁熱分裝于100ml的三角錐形瓶中，分裝量每瓶約30-40ml左右，三角錐形瓶口采用無菌培養(yǎng)容器封口膜封口。
1.4.3 固體培養(yǎng)基配方：金藻門、綠藻門、硅藻門、黃藻門配方如下：
1.4.4 固體培養(yǎng)基滅菌將分裝好的固體培養(yǎng)基放入高壓滅菌器，壓力15磅，溫度121℃，時間三十分鐘。
1.4.5 接種與培養(yǎng)在超凈工作臺上或酒精燈下，將上述藻液接種至已冷卻固體培養(yǎng)基中，一般采用接種環(huán)刺穿培養(yǎng)基表面劃“之”或“井”字線法，接種完畢的固體培養(yǎng)基置于溫度20-25℃、自然光照(3000-5000lux左右，避免直射光)的環(huán)境條件中培養(yǎng)，約十天，即可發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上有藻落生長。
1.4.6低溫保藏將藻落生長良好的固體培養(yǎng)基置于10℃的低溫培養(yǎng)箱中，自然光照即可。在此條件下，藻種可以保藏2-3年左右。
2．結(jié)果與分析
2.1結(jié)果：在藻種接種后一周，部分藻種的固體培養(yǎng)基內(nèi)藻細胞逐漸繁殖起來，一個月后，發(fā)現(xiàn)試驗一中綠藻門的小球藻，黃藻門的異膠藻、硅藻門的中肋骨條藻、牟氏角毛藻、金藻門的幾種金藻，藻群群落都能正常生長。試驗二中除金藻門及牟氏角毛藻外，其他藻都能正常生長。
2.2討論
(1)試驗一與試驗二固體培養(yǎng)基中營養(yǎng)成份所不同的足提供氮源的營養(yǎng)鹽不同。試驗一為尿素，試驗二為硝酸鈉，可見不同的氮源在單胞藻保種過程中起著不同的作用。分析原因，是因為球等鞭3010、301l、湛江叉鞭藻、牟氏角毛藻等單細胞藻具有尿素酶，能分解尿素作氮源，而利用硝酸鈉作氮源，需要將硝態(tài)氮還原成銨態(tài)氮，這幾種藻含有的異養(yǎng)菌較少，又由于處于無菌的環(huán)境中，所以藻種在試驗一中能正常生長，而在試驗二中不能正常生長。
(2)單胞藻的提純：采用固體培養(yǎng)基接種保藏方法，常發(fā)現(xiàn)雜藻藻落存在，可采用接種環(huán)將所需藻種重新接種至預備固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)保藏，這樣反復幾次，使藻種得到提純。
(3)瓊脂：在添加瓊脂時不能機械的照搬資料中介紹的2%用量，要根據(jù)瓊脂的質(zhì)量靈活使用，可預先多做幾組培養(yǎng)基試驗了解瓊脂的特性，不同質(zhì)量的瓊脂所添加的量是不同的，培養(yǎng)基太硬，影響營養(yǎng)鹽的緩釋，水分易失去，不利藻群的生長，培養(yǎng)基太軟又起不到固體低溫保存延長保種時間的目的?？傊?，要具體問題具體分析，有時可根據(jù)保種的需要制成半固體狀態(tài)的培養(yǎng)基，一方面營養(yǎng)鹽緩慢釋放，另一方面，水分含量較高，培養(yǎng)基不易干燥，有利于藻種的保存。
(4)EDTA-Na：EDTA-Na能絡和海水中的重金屬離子但同時也將單胞藻生長繁殖需要的微量元素絡和掉了，用量要小，一般不能超過5mg/L。在保種時，固體培養(yǎng)基不使用EDTA-Na藻群也能正常生長。
很好