關(guān)鍵詞:單細(xì)胞藻種,固體培養(yǎng)基,保種

氮源單細(xì)胞(Unicelluler)藻種的保藏一直是制約工廠化育苗生產(chǎn)中單胞藻正常供應(yīng)和長(zhǎng)期保存的重要因素。通常采用液體保藏方法，周期短、易污染、保藏條件：難以控制，容易造成藻種保種失敗。

采用固體培養(yǎng)基保藏，可以通過營(yíng)養(yǎng)成分的緩釋作用，在適宜的條件下延長(zhǎng)保藏期2~3年。

但需解決一些關(guān)鍵問題，一是藻種的提純技術(shù)，二是選擇合適的固體培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分，否則接種保藏難以取得良好的效果。國(guó)內(nèi)有關(guān)固體培養(yǎng)基保藏藻種的實(shí)用技術(shù)詳細(xì)報(bào)道不是很多，大部分僅作粗略介紹，有些在實(shí)際應(yīng)用中效果不理想，如金藻門(Chrysophyta)的球等鞭金藻3010、3011、湛江叉鞭藻、顆石藻以及硅藻門的牟氏角毛藻等，按照資料中介紹以硝酸鈉為氮源、2％瓊脂制成的培養(yǎng)基來培養(yǎng)保存藻種往往失敗。而改用以尿素為氮源，5~6‰瓊脂制成的培養(yǎng)基保種，藻種生長(zhǎng)正常并且易提純。

其它綠藻門(Chlorophyta)、硅藻門(Bacillariophyta)、和黃藻門(Xanthophyta)等海洋單細(xì)胞藻種固體培養(yǎng)基保藏方法也可以用此方法?，F(xiàn)介紹如下：

1、材料與方法
1.1 儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)、Nikon攝影顯微鏡、生化培養(yǎng)箱、電熱蒸汽壓力消毒器、電子天平、電熱爐、無菌封口膜、三角錐形瓶、移液管、酒精燈、接種針等。
1.2?試劑藥品：純化瓊脂粉、尿素、硝酸鈉、磷酸二氫鉀、魯歌氏溶液、檸檬酸鐵、硅酸鈉、碳酸氫鈉、山梨酸鉀、EDTA-Na、VB1、VB12等。
1.3?藻類材料：球等鞭金藻(Isochrysis galbana OA-3011、OA-3010)、湛江等鞭金藻 (Isochrysis zhangjiangensis?Hu&Liu)、Coccolithus藻、綠色巴夫藻(Pavlova viridis?)、牟氏角毛藻(Chaetoceros meülleri?Lemmermann)、異膠藻(Heterogioea sp．)、小球藻Chlorella sp.)、中肋骨條藻(?Skeletonema costatum?Greville)。

1.4?方法：

1.4.1 藻種液的制備：在固體培養(yǎng)基接種前一周將上述單細(xì)胞藻種分別無菌接種，目的是確保固體培養(yǎng)基接種時(shí)藻群處于指數(shù)生長(zhǎng)期。

1.4.2 固體培養(yǎng)基的制備：固體培養(yǎng)基制備按照下述(1.4.3)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分配制培養(yǎng)液，營(yíng)養(yǎng)成分的加入順序依次為N、P、Fe、Si、VB、NaHC03、山梨酸鉀、EDTA-Na等。每加入一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，?都要攪拌均勻，再加入第二種。最后加入瓊脂，營(yíng)養(yǎng)液配好后置于可調(diào)溫電熱爐上加熱微融化。趁熱分裝于100ml的三角錐形瓶中，分裝量每瓶約30-40ml左右，三角錐形瓶口采用無菌培養(yǎng)容器封口膜封口。

1.4.3 固體培養(yǎng)基配方：金藻門、綠藻門、硅藻門、黃藻門配方如下：

1.4.4 固體培養(yǎng)基滅菌將分裝好的固體培養(yǎng)基放入高壓滅菌器，壓力15磅，溫度121℃，時(shí)間三十分鐘。

1.4.5 接種與培養(yǎng)在超凈工作臺(tái)上或酒精燈下，將上述藻液接種至已冷卻固體培養(yǎng)基中，一般采用接種環(huán)刺穿培養(yǎng)基表面劃“之”或“井”字線法，接種完畢的固體培養(yǎng)基置于溫度20-25℃、自然光照(3000-5000lux左右，避免直射光)的環(huán)境條件中培養(yǎng)，約十天，即可發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上有藻落生長(zhǎng)。

1.4.6低溫保藏將藻落生長(zhǎng)良好的固體培養(yǎng)基置于10℃的低溫培養(yǎng)箱中，自然光照即可。在此條件下，藻種可以保藏2-3年左右。

2．結(jié)果與分析

2.1結(jié)果：在藻種接種后一周，部分藻種的固體培養(yǎng)基內(nèi)藻細(xì)胞逐漸繁殖起來，一個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)一中綠藻門的小球藻，黃藻門的異膠藻、硅藻門的中肋骨條藻、牟氏角毛藻、金藻門的幾種金藻，藻群群落都能正常生長(zhǎng)。試驗(yàn)二中除金藻門及牟氏角毛藻外，其他藻都能正常生長(zhǎng)。

2.2討論
(1)試驗(yàn)一與試驗(yàn)二固體培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成份所不同的足提供氮源的營(yíng)養(yǎng)鹽不同。試驗(yàn)一為尿素，試驗(yàn)二為硝酸鈉，可見不同的氮源在單胞藻保種過程中起著不同的作用。分析原因，是因?yàn)榍虻缺?010、301l、湛江叉鞭藻、牟氏角毛藻等單細(xì)胞藻具有尿素酶，能分解尿素作氮源，而利用硝酸鈉作氮源，需要將硝態(tài)氮還原成銨態(tài)氮，這幾種藻含有的異養(yǎng)菌較少，又由于處于無菌的環(huán)境中，所以藻種在試驗(yàn)一中能正常生長(zhǎng)，而在試驗(yàn)二中不能正常生長(zhǎng)。

(2)單胞藻的提純：采用固體培養(yǎng)基接種保藏方法，常發(fā)現(xiàn)雜藻藻落存在，可采用接種環(huán)將所需藻種重新接種至預(yù)備固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)保藏，這樣反復(fù)幾次，使藻種得到提純。

(3)瓊脂：在添加瓊脂時(shí)不能機(jī)械的照搬資料中介紹的2%用量，要根據(jù)瓊脂的質(zhì)量靈活使用，可預(yù)先多做幾組培養(yǎng)基試驗(yàn)了解瓊脂的特性，不同質(zhì)量的瓊脂所添加的量是不同的，培養(yǎng)基太硬，影響營(yíng)養(yǎng)鹽的緩釋，水分易失去，不利藻群的生長(zhǎng)，培養(yǎng)基太軟又起不到固體低溫保存延長(zhǎng)保種時(shí)間的目的?？傊?，要具體問題具體分析，有時(shí)可根據(jù)保種的需要制成半固體狀態(tài)的培養(yǎng)基，一方面營(yíng)養(yǎng)鹽緩慢釋放，另一方面，水分含量較高，培養(yǎng)基不易干燥，有利于藻種的保存。

(4)EDTA-Na：EDTA-Na能絡(luò)和海水中的重金屬離子但同時(shí)也將單胞藻生長(zhǎng)繁殖需要的微量元素絡(luò)和掉了，用量要小，一般不能超過5mg/L。在保種時(shí)，固體培養(yǎng)基不使用EDTA-Na藻群也能正常生長(zhǎng)。