微藻已被確定為生產(chǎn)高質(zhì)量生物質(zhì)和后續(xù)生物產(chǎn)品（如食品、飼料、營養(yǎng)補充劑、重組蛋白和生物燃料）的替代平臺。治療性蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)生物技術(shù)宿主，如大腸桿菌和哺乳動物CHO細(xì)胞，早已被確定為主要平臺，但最近的研究進展表明，微藻可能成為一種替代平臺。在本研究中，我們研究了萊茵衣藻在高密度異養(yǎng)培養(yǎng)中生產(chǎn)復(fù)雜人類重組蛋白的潛力。重組人蛋白ICAM-1的目標(biāo)是使用補料分批策略從生物反應(yīng)器中生長的細(xì)胞分泌到培養(yǎng)物的細(xì)胞外培養(yǎng)基，以實現(xiàn)高細(xì)胞密度。最終，這導(dǎo)致最大生物量滴度為40 g/L，重組蛋白滴度為50 mg/L。通過對其天然配體LFA-1的結(jié)合測定，藻類產(chǎn)生的ICAM-1蛋白顯示出與哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的ICAM-1相當(dāng)?shù)纳锘钚?。這項工作表明，萊茵梭菌是使用補料分批異養(yǎng)生長策略在高濃度下生產(chǎn)具有天然生物活性的復(fù)雜重組蛋白的可行選擇。
微藻是一類高度多樣的生物，主要由其光合生長能力來定義，盡管許多藻類也具有在有機基質(zhì)上異養(yǎng)生長的能力。由于代謝的可塑性和潛在的培養(yǎng)策略，微藻可用于生產(chǎn)廉價的商品產(chǎn)品，如生物燃料和材料，以及高價值產(chǎn)品，如重組蛋白質(zhì)和治療性化合物。萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）就是這樣一種既能自養(yǎng)又能異養(yǎng)生長的菌株，它是一種綠色微藻，幾十年來一直被用作模式生物，用于研究各種生物現(xiàn)象，包括光合作用、鞭毛運動、細(xì)胞器遺傳學(xué)和細(xì)胞周期[5]。最值得注意的是，該物種擁有一套開發(fā)的分子工具來促進遺傳操作，多年來，該藻類中已經(jīng)產(chǎn)生了許多重組蛋白
由于之前在萊茵梭菌中所做的分子生物學(xué)工作，所有三個基因組（核、葉綠體和線粒體）都已測序和注釋，并且所有三個都能夠進行遺傳轉(zhuǎn)化。此外，重組蛋白在葉綠體和核基因組中都有表達，復(fù)雜的哺乳動物蛋白在兩個基因組中都有表達。C、 reinhardtii還能夠進行有性重組，這已被證明是在轉(zhuǎn)基因策略和高通量篩選技術(shù)的基礎(chǔ)上增加重組蛋白產(chǎn)量的有效手段[14]
萊茵梭菌的重組蛋白生產(chǎn)傳統(tǒng)上在葉綠體中更為成功，因為其遺傳學(xué)更為簡單，而且單個細(xì)胞器可以占細(xì)胞體積的70%。一些感興趣的重組蛋白已在葉綠體中表達，在非光合突變株[15]中產(chǎn)量高達總可溶性蛋白（TSP）的10.5%，但更典型的是TSP的0.5%到5%不等。葉綠體中重組蛋白生產(chǎn)的缺點是，一些翻譯后修飾沒有添加到葉綠體生產(chǎn)的蛋白質(zhì)中，例如糖基化，這可能對蛋白質(zhì)的生物活性至關(guān)重要，并且葉綠體中表達的重組蛋白不能針對其他亞細(xì)胞定位，阻礙某些代謝工程的可能性。在細(xì)胞核中表達的重組蛋白可以靶向細(xì)胞內(nèi)的不同位置，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而接受翻譯后修飾，如糖基化。復(fù)雜的基因表達調(diào)控，以及對轉(zhuǎn)基因隨機整合到核基因組的強烈偏好，阻礙了核轉(zhuǎn)基因的重組蛋白表達。據(jù)報道，通過核基因組轉(zhuǎn)化獲得的重組蛋白滴度范圍為0.7 mg/L至15 mg/L，這對應(yīng)于大多數(shù)核表達重組蛋白的總可溶性蛋白滴度為0.5%或更低。
提高萊茵梭菌中的重組蛋白滴度，我們可以控制三個因素：單個細(xì)胞系中的重組蛋白產(chǎn)量、培養(yǎng)物中的總生物量濃度以及重組蛋白在細(xì)胞內(nèi)或培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性。為了直接增加單個細(xì)胞系中的重組蛋白產(chǎn)量，我們可以修改啟動子或其他遺傳元件以增加轉(zhuǎn)錄，或通過使用誘變和交配進行間接遺傳修改，然后進行篩選以識別蛋白質(zhì)積累增加的系。這些間接遺傳修飾可能涉及阻礙重組蛋白積累的天然蛋白酶的下調(diào)，或者可能涉及伴侶和其他促進重組蛋白折疊的酶的改變，從而減少新合成蛋白質(zhì)的聚集和降解。通過改變培養(yǎng)物生長條件，例如降低培養(yǎng)物溫度以防止錯誤折疊，也可以影響重組蛋白降解和/或聚集的預(yù)防[23]。最后，只要在這些改變的生長條件下蛋白質(zhì)表達保持高水平，增加總生物量濃度也是提高重組蛋白產(chǎn)量的有效途徑。這可以通過改進培養(yǎng)技術(shù)、優(yōu)化培養(yǎng)基或選擇在高生物量生長下表現(xiàn)良好的菌株來實現(xiàn)。
在簡單的分批生長中，最終生物量滴度受分批運行開始時添加的基質(zhì)量的限制。最常見的消耗醋酸鹽作為有機碳基質(zhì)，然而，培養(yǎng)基中高濃度的醋酸鹽抑制藻類生長，從而限制了產(chǎn)生的總生物量。當(dāng)使用補料分批策略時，醋酸鹽可以在細(xì)胞消耗時超時添加，因此可以避免底物抑制的問題。幾種策略已被用于萊茵梭菌的補料分批生長。據(jù)報道，使用乙酸鈉的補料分批系統(tǒng)可產(chǎn)生1.5 g/L的生物量，但鈉的累積會抑制進一步的生長。為了解決這個問題，同一團隊設(shè)計了一個中空纖維細(xì)胞回收系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中，使用過的培養(yǎng)基被丟棄，而細(xì)胞被保存在生物反應(yīng)器中，從而產(chǎn)生9克/升。Fields等人部署的另一種分批補料策略包括使用pH計喂食萊茵梭菌乙酸，以控制酸性基質(zhì)的添加，這導(dǎo)致報告的最高生長速率和生物量滴度為23.69 g/L生物量。然而，與其他能夠消耗葡萄糖作為基質(zhì)的綠藻（如小球藻和柵藻）相比，即使是生長中獲得的最高生物量滴度也大大降低，其中生物量滴度分別達到271 g/L和286 g/L。
