微型單細胞藻類的分離和培養(yǎng)方法基本上與菌類的方法相似，但還需加上光照條件，并以液體培養(yǎng)為主。在大量培養(yǎng)時，可不必考慮無菌條件。
上海光語生物科技有限公司提供的光生物反應器可以用來實驗室培養(yǎng)藻類。
一、目的
學習藻類的分離和培養(yǎng)方法
二、藥品、材料和用具
水生生物培養(yǎng)槽，玻璃片（面積稍大于培養(yǎng)槽），橡皮管，顯微鏡，三角燒瓶，試管，篩絹，棉塞，微吸管，凹玻片，滅菌鍋，載玻片，吸管，培養(yǎng)皿，人工光源，木盆（或小型實驗池），充二氧化碳氣鋼瓶，抽氣泵，離心機。
土壤抽出液，青霉素，鏈霉素，瓊脂，硝酸鈣，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，過磷酸鈣，硫酸鎂，氯化鉀，碳酸鈉，三氯化鐵，硅酸鈉，葡萄糖，蛋白胨，硫酸銨，硝酸銨，氯化鈣，碳酸氫鈉，鉬酸，氯化鈉，檸檬酸鐵，硫酸錳，人尿，海泥抽出液，食鹽。
三、操作
生長在靜水或水流緩慢河流中的藻類，培養(yǎng)比較容易。取到實驗室后，要立刻從材料瓶中移到寬大的水生生物培養(yǎng)槽內。為了培養(yǎng)大的絲狀藻，要利用寬的、不高的容器。這些容器要用玻片蓋住，以防止培養(yǎng)物受灰塵沾污。倒入容器的水要達到容器高度的一半，或稍多些，使水面上還有充分空氣。在容器邊緣，要用一小塊縱切橡皮管墊住，可使玻片不致緊貼容器，空氣才能進入容器中。細微的藻類如團藻目、硅藻門能很好地生活于培養(yǎng)皿中。很多藻類如顫藻屬、水綿屬的若干種、輪藻屬等可在實驗室中保存很多年。
在迅速流動水中生長的藻如絲藻屬、毛枝藻屬等比較難于培養(yǎng)，因為它們要求經(jīng)常輸入氧氣。在水層較高水中，在高容器中，這些藻類迅速地死亡。為了把這些藻類保存到實驗時，應當把它們分成一些小部分，放在水層較薄的、寬的容器內，并須常常換水，把空氣吹入水中。還可以用橡皮管把水生生物培養(yǎng)槽和水龍頭連結起來，建立有流水的水生生物培養(yǎng)槽。
在水生生物培養(yǎng)槽中培養(yǎng)藻類時，應盡可能創(chuàng)造和保持藻類天然生存條件。把藻類培養(yǎng)在從采集藻類那一水域取來的水中，或其他天然水（尤其不能用自來水，因其中含很多氯氣，必要的話，也須置較長時間，或加以煮開），或在水中加入混合養(yǎng)料，這些養(yǎng)料是由制造有機物質所必需的礦質鹽構成。
在夏季，不要把藻類培養(yǎng)物放在直射太陽光下，而要放在涼爽的場所，例如向北窗臺上。在秋、冬季節(jié)，如希望藻類保持積極生活活動狀態(tài)，就要把培養(yǎng)物移到有人工光照處。
以上是一般藻類粗放的培養(yǎng)、保存方法。如要作較深入實驗，需注意以下問題：
1．藻種的分離
藻類培養(yǎng)首先要有藻種。從天然水域的混雜生物群中，用一定方法把所需藻類個體分離出來，而獲純種培養(yǎng)。這種方法稱為藻種分離和純化，又稱純培養(yǎng)法。
真正的“純種培養(yǎng)”是指在排除包括細菌在內的一切生物的條件下進行的培養(yǎng)。這是進行科學研究不可缺少的技術，而在生產性培養(yǎng)中不排除細菌的稱之為“單種培養(yǎng)”。
（1）采樣和預備培養(yǎng)：首先要采集有需要分離藻類的水樣，采回后在顯微鏡下檢查。如發(fā)現(xiàn)需要分離的藻類數(shù)量較多時，可立即分離。若數(shù)量很少，最好先進行預備培養(yǎng)，待其增多后，再分離。
用作預備培養(yǎng)的培養(yǎng)液，各種藻類是不同的，對一些難以培養(yǎng)的藻類一般加入土壤抽出液較好。預備培養(yǎng)液營養(yǎng)成分濃度應小些，一般只有原配方的1/4～1/2。如水樣中藻類種類較多，就應使用幾種不同的培養(yǎng)液，使藻類在適合于自己繁殖的培養(yǎng)液中繁殖起來。
可用三角燒瓶或試管作培養(yǎng)容器，加入容量1/4～1/3培養(yǎng)液。然后把經(jīng)篩絹過濾除去大型浮游生物的水樣接種進去，放在合適溫度下或室內靠北窗口下培養(yǎng)。在培養(yǎng)附著藻類時，容器可靜止不動；而培養(yǎng)浮游藻類時，應該每天搖動一次。
有的藻類在普通培養(yǎng)液中完全不能繁殖，有的繁殖非常困難。此時需改變培養(yǎng)液濃度，加入葡萄糖、蛋白胨等有機物，補充微量元素和輔助生長物質，加入土壤抽出液，就有可能獲較好效果。
土壤抽出液制作方法：先在試管底部，加入高約1cm土壤（采用腐殖化的農田和庭院土）。再加入水使達5cm，塞上棉塞，采用蒸氣間隙滅菌，每天滅菌1小時，連續(xù)二天。由于氣泡上升，棉塞可能弄臟。因此，最好先在水中煮一段時間，使氣泡跑掉后，再加棉塞進行滅菌。
（2）分離方法：常用下列四種。
1）微吸管（毛細管）分離?選直徑較細（約5毫米）玻管，在火焰上加熱，待快熔時，快速拉成口徑極細的微吸管。將稀釋適度藻液水樣，置淺凹載玻片上，鏡檢。用微吸管挑選要分離的藻體，認真仔細地吸出，放入另一淺凹載片上，鏡檢這一滴水中是否達到純分離的目的。如不成功，應反復幾次，直至達到分離目的為止。然后移入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，一般在每個培養(yǎng)皿中接20～30個個體。從分離出少量細胞擴大培養(yǎng)到200毫升的培養(yǎng)量，如硅藻一般需20天以上。為了較長時期保存藻種，可將分離到的藻種用青霉素（1000～5000單位或鏈霉素（20ppm）處理后，獲得較純藻種。
此法操作技術要求高，要細心。往往吸取一個細胞，要反復幾次才能成功，且適于分離個體較大藻類。
2）水滴分離法?用微吸管吸取稀釋適度藻液，滴到消毒過載片上，水滴盡可能滴小些，要求在低倍鏡視野中能看到水滴全部或大部分。一個載片上滴2～4滴，間隔一定距離，作直線排列。如一滴水中只有幾個所需同種藻類個體，無其他生物混雜，即用吸管吸取培養(yǎng)液，把這滴水沖入裝有培養(yǎng)液并經(jīng)滅菌試管或小三角瓶中去。如未成功，需反復重做，直到達到目的。
此法簡便易行，尤其適宜于分離已在培養(yǎng)液中占優(yōu)勢種類。分離受少量生物污染培養(yǎng)液中的藻類多用此法。操作時同樣要求細致、認真，使用工具及培養(yǎng)液經(jīng)嚴格消毒。
3）稀釋分離法?把含有需要分離的藻類而又混雜有其他生物的水樣，取其一定量，用培養(yǎng)液稀釋。通過稀釋到適宜程度的方法，達到把原混雜生物單個分離培養(yǎng)的目的。
首先把水樣稀釋到每一滴含有一個左右的生物細胞（也可能一個都沒有，也可能有兩個），在稀釋過程中配合顯微鏡檢查，調節(jié)稀釋度，然后準備裝有1/4容量培養(yǎng)液的試管20支，每一試管加入稀釋適宜水樣一滴，搖勻，進行培養(yǎng)。待藻類生長繁殖達一定濃度時，再檢查是否達到分離目的，若未達到，再重復做。
此法操作簡單易行，但有一定程度盲目性，比不上水滴分離法效果好。
4）平板分離法?這個方法的培養(yǎng)基制備和分離方法，與菌類的平板分離法基本相同，只是培養(yǎng)基配方不同。也可將稀釋藻液裝入消毒過的小型噴霧器中（可使用醫(yī)用喉頭噴霧器），打開培養(yǎng)皿蓋，把藻液噴射在培養(yǎng)基平面上，形成分布均勻的薄層水珠。
接種后，蓋上蓋，放在適宜的光、溫條件下培養(yǎng)。一般經(jīng)過十余天，就可在培養(yǎng)基上發(fā)生互相隔離的藻類群落，通過顯微鏡檢查，尋找需要的純藻群落，然后用消毒過的接種環(huán)移植到另一平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，也可直接移植到裝有培養(yǎng)液并經(jīng)過滅菌的試管或小三角燒瓶中，加消毒棉花塞子，進行培養(yǎng)。
此法較繁，但難度不大，而且可看到是否污染雜菌，對于分離已污染雜菌培養(yǎng)液的藻類更合適。
5）底棲藻的分離?在顯微鏡或放大鏡下挑取個體，一般可接種在固體培養(yǎng)基平板上，反復挑選、培養(yǎng)。
6）分離浮游藍藻?可利用其浮力大，易浮起在水面的特性；分離硅藻則可利用其易沉淀的特性。
用以上各種方法分離到藻種，需放在適宜光照條件下（靠南或北窗口附近光線充足處，但嚴防陽光直射）培養(yǎng)，有條件的可控制溫度和利用人工光源。培養(yǎng)時，每天輕輕搖動1～2次，但需注意勿把培養(yǎng)液沾濕棉塞，避免雜菌污染。經(jīng)一段時間后，培養(yǎng)物顏色逐漸變深。再經(jīng)一次顯微鏡檢查，如無其他混雜生物，才達到單種培養(yǎng)目的。
2．藻種的培養(yǎng)
獲得單種培養(yǎng)后，一方面擴大培養(yǎng)，另一方面可把藻種作較長時間保存，需要時隨時取出使用。藻種培養(yǎng)要求比較嚴格，培養(yǎng)容器可用各種不同大小的三角燒瓶，容量有100、300、500、1000毫升，適于逐漸擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)容器和工具需經(jīng)煮沸滅菌或使用化學藥品滅菌后，用煮沸水沖洗，培養(yǎng)液用加熱滅菌法滅菌。按種后瓶口用滅菌紙包扎，放在適宜光、溫條件下培養(yǎng)，每天輕輕搖動二次。大約二周后進行一次移植。藻種在培養(yǎng)過程中必須定期用顯微鏡檢查，保持不受其他生物污染。
3．藻種的保藏
可接在固體培養(yǎng)基上，在常溫、弱光下保藏半年到一年；也可在低溫下（冰箱內）保藏，每天接受短時間（幾個小時）弱光，可保藏2～3年；如不照光，只能保藏幾個月。保藏藻種所用培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分濃度應比正常培養(yǎng)基高一些，一般可增加一倍，瓊脂量為1～1.5％。也可在固體培養(yǎng)基上，再加培養(yǎng)液，然后接種到培養(yǎng)液中，可以避免固體培養(yǎng)基干涸，保藏效果比單用固體好。
4．培養(yǎng)液和培養(yǎng)基的配方
配方極多，每種配方主要適用于一定藻種，這里介紹比較常用的幾種：
水生4號和克諾普（Knop）培養(yǎng)液，一般用于綠藻；藍藻可用朱氏10號或水生105號無氮培養(yǎng)基（后者適于固氮藍藻）；硅藻可用朱氏10號和水生硅1號培養(yǎng)基；另外還有海產綠藻、硅藻的培養(yǎng)基。常用培養(yǎng)基配方見表1。
以上用水量都是加至1000mL，海藻培養(yǎng)液用海水，如無海水可用淡水1000mL加30克食鹽代替。土壤抽出液用菜園土1份和水2份比例混合攪勻，靜置，取上清液；海泥抽出液也可用同樣比例制備。如配制固體培養(yǎng)基，可在培養(yǎng)液內加入1.5％瓊脂。
從以上各種配方，可看到配制藻類培養(yǎng)液的幾條原則：
（1）要有適量氮源（除固氮藍藻外），如氨鹽、硝酸鹽、有機氮等。
（2）應包括主要元素鉀、磷、鎂、硫、鈣等。
（3）要考慮各種鹽類總濃度和pH是否適合藻類需要，可用碳酸氫鈉調節(jié)pH。
（4）要加入各種藻類需要的微量元素，如鐵、錳、銅、鋅等（后幾種包括在土壤抽出液中）。
（5）要滿足某些藻類特殊需要，如藍藻需鉬，硅藻需硅。
（6）要添加適量生長物質如維生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。
5．大量培養(yǎng)過程
包拈接種、培養(yǎng)、采收等。
（1）接種：一般要求選取生活力強、生長旺盛藻種?？上葘饪s藻種用連續(xù)稀釋法，制備一定濃度的懸浮藻液，然后接入培養(yǎng)容器。接種時注意藻種和培養(yǎng)液比例要適當，使藻細胞在新培養(yǎng)液中達到一定數(shù)量。使一開始培養(yǎng)，藻類在培養(yǎng)液中占優(yōu)勢，另一方面還可縮短培養(yǎng)周期，這是培養(yǎng)得到成功的經(jīng)驗之一。在環(huán)境條件不很適合情況下，更需提高接種量。一般所用藻種濃度，根據(jù)藻類體積大小，每毫升30萬～300萬個，采用1∶2～1∶5的比例。還需注意接種時間，在自然光條件下，最好在上午8～10時，不宜在晚上。尤其是能運動種類，此時明顯向上浮游，接種時可把上浮優(yōu)質藻類吸出做藻種，起選種作用。
（2）培養(yǎng)管理：主要是使已接種培養(yǎng)物在相對穩(wěn)定適宜環(huán)境中大量繁殖生長。要注意以下因素：
1）二氧化碳濃度在開放式不通氣方法培養(yǎng)中，攪拌是十分必要的，可以增加水和空氣的接觸面，使空氣中二氧化碳溶解到培養(yǎng)液中，而且?guī)椭恋碓孱惣毎细～@得光照。在通氣培養(yǎng)中，培養(yǎng)液內應維持二氧化碳濃度在0.1～5％之間。
2）光照強度?利用太陽光源培養(yǎng)時，一般在室內培養(yǎng)可放在近窗口地方，防止強直射光照射。或利用人工光源（60～100瓦電燈或日光燈），需1500～3000勒克斯/厘米2。
3）溫度?適溫一般在10～30℃之間，最適溫常為20～25℃。若在室外培養(yǎng)，夏季中午高溫，冬季早晚低溫，常造成不利影響，需設法調節(jié)。
4）無機營養(yǎng)?應不斷添加新鮮培養(yǎng)液，及時補充被藻吸收后減少了的某些元素。
5）注意pH變化?如變動過大，可用酸、堿調節(jié)。
6）適當控制培養(yǎng)物中藻細胞濃度?過高會引起光照和無機營養(yǎng)不足，并導致pH上升。一般控制在0.3g（干重）/L范圍內。
7）及時觀察和檢查藻類生長情況?可以通過培養(yǎng)物呈現(xiàn)的顏色、藻類細胞運動情況、是否有沉淀附壁、菌膜及敵害生物污染跡象等觀察而了解一般的生長情況。藻種和中繼培養(yǎng)每半月進行一次全面顯微鏡檢查。大量培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)有不正?，F(xiàn)象，應立即鏡檢，目的有兩個：了解藻細胞生長情況，并檢查有無敵害生物污染。
（3）采收：培養(yǎng)液中藻體的適時采收，既是培養(yǎng)的目的，也是繼續(xù)培養(yǎng)的手段。因為通過采收一部分藻體，可使藻細胞濃度保持恒定。通常在培養(yǎng)物細胞濃度達到干重0.4～0.5克/升時，即可采收培養(yǎng)總量1/3的藻體。
采收時，先攪拌培養(yǎng)物，取出1/3量藻液，置于沉淀缸中，加入2％～3％明礬或6％飽和石灰水。約1～2小時，藻細胞即可完全沉淀，取出沉淀，離心、濃縮、烘干。在大型培養(yǎng)池中采收藻體，可另外設計適當?shù)墓に嚵鞒獭?/span>