微型單細(xì)胞藻類的分離和培養(yǎng)方法基本上與菌類的方法相似，但還需加上光照條件，并以液體培養(yǎng)為主。在大量培養(yǎng)時(shí)，可不必考慮無(wú)菌條件。
上海光語(yǔ)生物科技有限公司提供的光生物反應(yīng)器可以用來(lái)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)藻類。
一、目的
學(xué)習(xí)藻類的分離和培養(yǎng)方法
二、藥品、材料和用具
水生生物培養(yǎng)槽，玻璃片（面積稍大于培養(yǎng)槽），橡皮管，顯微鏡，三角燒瓶，試管，篩絹，棉塞，微吸管，凹玻片，滅菌鍋，載玻片，吸管，培養(yǎng)皿，人工光源，木盆（或小型實(shí)驗(yàn)池），充二氧化碳?xì)怃撈?，抽氣泵，離心機(jī)。
土壤抽出液，青霉素，鏈霉素，瓊脂，硝酸鈣，磷酸二氫鉀，磷酸氫二鉀，過(guò)磷酸鈣，硫酸鎂，氯化鉀，碳酸鈉，三氯化鐵，硅酸鈉，葡萄糖，蛋白胨，硫酸銨，硝酸銨，氯化鈣，碳酸氫鈉，鉬酸，氯化鈉，檸檬酸鐵，硫酸錳，人尿，海泥抽出液，食鹽。
三、操作
生長(zhǎng)在靜水或水流緩慢河流中的藻類，培養(yǎng)比較容易。取到實(shí)驗(yàn)室后，要立刻從材料瓶中移到寬大的水生生物培養(yǎng)槽內(nèi)。為了培養(yǎng)大的絲狀藻，要利用寬的、不高的容器。這些容器要用玻片蓋住，以防止培養(yǎng)物受灰塵沾污。倒入容器的水要達(dá)到容器高度的一半，或稍多些，使水面上還有充分空氣。在容器邊緣，要用一小塊縱切橡皮管墊住，可使玻片不致緊貼容器，空氣才能進(jìn)入容器中。細(xì)微的藻類如團(tuán)藻目、硅藻門能很好地生活于培養(yǎng)皿中。很多藻類如顫藻屬、水綿屬的若干種、輪藻屬等可在實(shí)驗(yàn)室中保存很多年。
在迅速流動(dòng)水中生長(zhǎng)的藻如絲藻屬、毛枝藻屬等比較難于培養(yǎng)，因?yàn)樗鼈円蠼?jīng)常輸入氧氣。在水層較高水中，在高容器中，這些藻類迅速地死亡。為了把這些藻類保存到實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)當(dāng)把它們分成一些小部分，放在水層較薄的、寬的容器內(nèi)，并須常常換水，把空氣吹入水中。還可以用橡皮管把水生生物培養(yǎng)槽和水龍頭連結(jié)起來(lái)，建立有流水的水生生物培養(yǎng)槽。
在水生生物培養(yǎng)槽中培養(yǎng)藻類時(shí)，應(yīng)盡可能創(chuàng)造和保持藻類天然生存條件。把藻類培養(yǎng)在從采集藻類那一水域取來(lái)的水中，或其他天然水（尤其不能用自來(lái)水，因其中含很多氯氣，必要的話，也須置較長(zhǎng)時(shí)間，或加以煮開），或在水中加入混合養(yǎng)料，這些養(yǎng)料是由制造有機(jī)物質(zhì)所必需的礦質(zhì)鹽構(gòu)成。
在夏季，不要把藻類培養(yǎng)物放在直射太陽(yáng)光下，而要放在涼爽的場(chǎng)所，例如向北窗臺(tái)上。在秋、冬季節(jié)，如希望藻類保持積極生活活動(dòng)狀態(tài)，就要把培養(yǎng)物移到有人工光照處。
以上是一般藻類粗放的培養(yǎng)、保存方法。如要作較深入實(shí)驗(yàn)，需注意以下問(wèn)題：
1．藻種的分離
藻類培養(yǎng)首先要有藻種。從天然水域的混雜生物群中，用一定方法把所需藻類個(gè)體分離出來(lái)，而獲純種培養(yǎng)。這種方法稱為藻種分離和純化，又稱純培養(yǎng)法。
真正的“純種培養(yǎng)”是指在排除包括細(xì)菌在內(nèi)的一切生物的條件下進(jìn)行的培養(yǎng)。這是進(jìn)行科學(xué)研究不可缺少的技術(shù)，而在生產(chǎn)性培養(yǎng)中不排除細(xì)菌的稱之為“單種培養(yǎng)”。
（1）采樣和預(yù)備培養(yǎng)：首先要采集有需要分離藻類的水樣，采回后在顯微鏡下檢查。如發(fā)現(xiàn)需要分離的藻類數(shù)量較多時(shí)，可立即分離。若數(shù)量很少，最好先進(jìn)行預(yù)備培養(yǎng)，待其增多后，再分離。
用作預(yù)備培養(yǎng)的培養(yǎng)液，各種藻類是不同的，對(duì)一些難以培養(yǎng)的藻類一般加入土壤抽出液較好。預(yù)備培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)成分濃度應(yīng)小些，一般只有原配方的1/4～1/2。如水樣中藻類種類較多，就應(yīng)使用幾種不同的培養(yǎng)液，使藻類在適合于自己繁殖的培養(yǎng)液中繁殖起來(lái)。
可用三角燒瓶或試管作培養(yǎng)容器，加入容量1/4～1/3培養(yǎng)液。然后把經(jīng)篩絹過(guò)濾除去大型浮游生物的水樣接種進(jìn)去，放在合適溫度下或室內(nèi)靠北窗口下培養(yǎng)。在培養(yǎng)附著藻類時(shí)，容器可靜止不動(dòng)；而培養(yǎng)浮游藻類時(shí)，應(yīng)該每天搖動(dòng)一次。
有的藻類在普通培養(yǎng)液中完全不能繁殖，有的繁殖非常困難。此時(shí)需改變培養(yǎng)液濃度，加入葡萄糖、蛋白胨等有機(jī)物，補(bǔ)充微量元素和輔助生長(zhǎng)物質(zhì)，加入土壤抽出液，就有可能獲較好效果。
土壤抽出液制作方法：先在試管底部，加入高約1cm土壤（采用腐殖化的農(nóng)田和庭院土）。再加入水使達(dá)5cm，塞上棉塞，采用蒸氣間隙滅菌，每天滅菌1小時(shí)，連續(xù)二天。由于氣泡上升，棉塞可能弄臟。因此，最好先在水中煮一段時(shí)間，使氣泡跑掉后，再加棉塞進(jìn)行滅菌。
（2）分離方法：常用下列四種。
1）微吸管（毛細(xì)管）分離?選直徑較細(xì)（約5毫米）玻管，在火焰上加熱，待快熔時(shí)，快速拉成口徑極細(xì)的微吸管。將稀釋適度藻液水樣，置淺凹載玻片上，鏡檢。用微吸管挑選要分離的藻體，認(rèn)真仔細(xì)地吸出，放入另一淺凹載片上，鏡檢這一滴水中是否達(dá)到純分離的目的。如不成功，應(yīng)反復(fù)幾次，直至達(dá)到分離目的為止。然后移入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，一般在每個(gè)培養(yǎng)皿中接20～30個(gè)個(gè)體。從分離出少量細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)到200毫升的培養(yǎng)量，如硅藻一般需20天以上。為了較長(zhǎng)時(shí)期保存藻種，可將分離到的藻種用青霉素（1000～5000單位或鏈霉素（20ppm）處理后，獲得較純?cè)宸N。
此法操作技術(shù)要求高，要細(xì)心。往往吸取一個(gè)細(xì)胞，要反復(fù)幾次才能成功，且適于分離個(gè)體較大藻類。
2）水滴分離法?用微吸管吸取稀釋適度藻液，滴到消毒過(guò)載片上，水滴盡可能滴小些，要求在低倍鏡視野中能看到水滴全部或大部分。一個(gè)載片上滴2～4滴，間隔一定距離，作直線排列。如一滴水中只有幾個(gè)所需同種藻類個(gè)體，無(wú)其他生物混雜，即用吸管吸取培養(yǎng)液，把這滴水沖入裝有培養(yǎng)液并經(jīng)滅菌試管或小三角瓶中去。如未成功，需反復(fù)重做，直到達(dá)到目的。
此法簡(jiǎn)便易行，尤其適宜于分離已在培養(yǎng)液中占優(yōu)勢(shì)種類。分離受少量生物污染培養(yǎng)液中的藻類多用此法。操作時(shí)同樣要求細(xì)致、認(rèn)真，使用工具及培養(yǎng)液經(jīng)嚴(yán)格消毒。
3）稀釋分離法?把含有需要分離的藻類而又混雜有其他生物的水樣，取其一定量，用培養(yǎng)液稀釋。通過(guò)稀釋到適宜程度的方法，達(dá)到把原混雜生物單個(gè)分離培養(yǎng)的目的。
首先把水樣稀釋到每一滴含有一個(gè)左右的生物細(xì)胞（也可能一個(gè)都沒(méi)有，也可能有兩個(gè)），在稀釋過(guò)程中配合顯微鏡檢查，調(diào)節(jié)稀釋度，然后準(zhǔn)備裝有1/4容量培養(yǎng)液的試管20支，每一試管加入稀釋適宜水樣一滴，搖勻，進(jìn)行培養(yǎng)。待藻類生長(zhǎng)繁殖達(dá)一定濃度時(shí)，再檢查是否達(dá)到分離目的，若未達(dá)到，再重復(fù)做。
此法操作簡(jiǎn)單易行，但有一定程度盲目性，比不上水滴分離法效果好。
4）平板分離法?這個(gè)方法的培養(yǎng)基制備和分離方法，與菌類的平板分離法基本相同，只是培養(yǎng)基配方不同。也可將稀釋藻液裝入消毒過(guò)的小型噴霧器中（可使用醫(yī)用喉頭噴霧器），打開培養(yǎng)皿蓋，把藻液噴射在培養(yǎng)基平面上，形成分布均勻的薄層水珠。
接種后，蓋上蓋，放在適宜的光、溫條件下培養(yǎng)。一般經(jīng)過(guò)十余天，就可在培養(yǎng)基上發(fā)生互相隔離的藻類群落，通過(guò)顯微鏡檢查，尋找需要的純?cè)迦郝洌缓笥孟具^(guò)的接種環(huán)移植到另一平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，也可直接移植到裝有培養(yǎng)液并經(jīng)過(guò)滅菌的試管或小三角燒瓶中，加消毒棉花塞子，進(jìn)行培養(yǎng)。
此法較繁，但難度不大，而且可看到是否污染雜菌，對(duì)于分離已污染雜菌培養(yǎng)液的藻類更合適。
5）底棲藻的分離?在顯微鏡或放大鏡下挑取個(gè)體，一般可接種在固體培養(yǎng)基平板上，反復(fù)挑選、培養(yǎng)。
6）分離浮游藍(lán)藻?可利用其浮力大，易浮起在水面的特性；分離硅藻則可利用其易沉淀的特性。
用以上各種方法分離到藻種，需放在適宜光照條件下（靠南或北窗口附近光線充足處，但嚴(yán)防陽(yáng)光直射）培養(yǎng)，有條件的可控制溫度和利用人工光源。培養(yǎng)時(shí)，每天輕輕搖動(dòng)1～2次，但需注意勿把培養(yǎng)液沾濕棉塞，避免雜菌污染。經(jīng)一段時(shí)間后，培養(yǎng)物顏色逐漸變深。再經(jīng)一次顯微鏡檢查，如無(wú)其他混雜生物，才達(dá)到單種培養(yǎng)目的。
2．藻種的培養(yǎng)
獲得單種培養(yǎng)后，一方面擴(kuò)大培養(yǎng)，另一方面可把藻種作較長(zhǎng)時(shí)間保存，需要時(shí)隨時(shí)取出使用。藻種培養(yǎng)要求比較嚴(yán)格，培養(yǎng)容器可用各種不同大小的三角燒瓶，容量有100、300、500、1000毫升，適于逐漸擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)容器和工具需經(jīng)煮沸滅菌或使用化學(xué)藥品滅菌后，用煮沸水沖洗，培養(yǎng)液用加熱滅菌法滅菌。按種后瓶口用滅菌紙包扎，放在適宜光、溫條件下培養(yǎng)，每天輕輕搖動(dòng)二次。大約二周后進(jìn)行一次移植。藻種在培養(yǎng)過(guò)程中必須定期用顯微鏡檢查，保持不受其他生物污染。
3．藻種的保藏
可接在固體培養(yǎng)基上，在常溫、弱光下保藏半年到一年；也可在低溫下（冰箱內(nèi)）保藏，每天接受短時(shí)間（幾個(gè)小時(shí)）弱光，可保藏2～3年；如不照光，只能保藏幾個(gè)月。保藏藻種所用培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分濃度應(yīng)比正常培養(yǎng)基高一些，一般可增加一倍，瓊脂量為1～1.5％。也可在固體培養(yǎng)基上，再加培養(yǎng)液，然后接種到培養(yǎng)液中，可以避免固體培養(yǎng)基干涸，保藏效果比單用固體好。
4．培養(yǎng)液和培養(yǎng)基的配方
配方極多，每種配方主要適用于一定藻種，這里介紹比較常用的幾種：
水生4號(hào)和克諾普（Knop）培養(yǎng)液，一般用于綠藻；藍(lán)藻可用朱氏10號(hào)或水生105號(hào)無(wú)氮培養(yǎng)基（后者適于固氮藍(lán)藻）；硅藻可用朱氏10號(hào)和水生硅1號(hào)培養(yǎng)基；另外還有海產(chǎn)綠藻、硅藻的培養(yǎng)基。常用培養(yǎng)基配方見表1。
以上用水量都是加至1000mL，海藻培養(yǎng)液用海水，如無(wú)海水可用淡水1000mL加30克食鹽代替。土壤抽出液用菜園土1份和水2份比例混合攪勻，靜置，取上清液；海泥抽出液也可用同樣比例制備。如配制固體培養(yǎng)基，可在培養(yǎng)液內(nèi)加入1.5％瓊脂。
從以上各種配方，可看到配制藻類培養(yǎng)液的幾條原則：
（1）要有適量氮源（除固氮藍(lán)藻外），如氨鹽、硝酸鹽、有機(jī)氮等。
（2）應(yīng)包括主要元素鉀、磷、鎂、硫、鈣等。
（3）要考慮各種鹽類總濃度和pH是否適合藻類需要，可用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH。
（4）要加入各種藻類需要的微量元素，如鐵、錳、銅、鋅等（后幾種包括在土壤抽出液中）。
（5）要滿足某些藻類特殊需要，如藍(lán)藻需鉬，硅藻需硅。
（6）要添加適量生長(zhǎng)物質(zhì)如維生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。
5．大量培養(yǎng)過(guò)程
包拈接種、培養(yǎng)、采收等。
（1）接種：一般要求選取生活力強(qiáng)、生長(zhǎng)旺盛藻種。可先將濃縮藻種用連續(xù)稀釋法，制備一定濃度的懸浮藻液，然后接入培養(yǎng)容器。接種時(shí)注意藻種和培養(yǎng)液比例要適當(dāng)，使藻細(xì)胞在新培養(yǎng)液中達(dá)到一定數(shù)量。使一開始培養(yǎng)，藻類在培養(yǎng)液中占優(yōu)勢(shì)，另一方面還可縮短培養(yǎng)周期，這是培養(yǎng)得到成功的經(jīng)驗(yàn)之一。在環(huán)境條件不很適合情況下，更需提高接種量。一般所用藻種濃度，根據(jù)藻類體積大小，每毫升30萬(wàn)～300萬(wàn)個(gè)，采用1∶2～1∶5的比例。還需注意接種時(shí)間，在自然光條件下，最好在上午8～10時(shí)，不宜在晚上。尤其是能運(yùn)動(dòng)種類，此時(shí)明顯向上浮游，接種時(shí)可把上浮優(yōu)質(zhì)藻類吸出做藻種，起選種作用。
（2）培養(yǎng)管理：主要是使已接種培養(yǎng)物在相對(duì)穩(wěn)定適宜環(huán)境中大量繁殖生長(zhǎng)。要注意以下因素：
1）二氧化碳濃度在開放式不通氣方法培養(yǎng)中，攪拌是十分必要的，可以增加水和空氣的接觸面，使空氣中二氧化碳溶解到培養(yǎng)液中，而且?guī)椭恋碓孱惣?xì)胞上浮獲得光照。在通氣培養(yǎng)中，培養(yǎng)液內(nèi)應(yīng)維持二氧化碳濃度在0.1～5％之間。
2）光照強(qiáng)度?利用太陽(yáng)光源培養(yǎng)時(shí)，一般在室內(nèi)培養(yǎng)可放在近窗口地方，防止強(qiáng)直射光照射。或利用人工光源（60～100瓦電燈或日光燈），需1500～3000勒克斯/厘米2。
3）溫度?適溫一般在10～30℃之間，最適溫常為20～25℃。若在室外培養(yǎng)，夏季中午高溫，冬季早晚低溫，常造成不利影響，需設(shè)法調(diào)節(jié)。
4）無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)?應(yīng)不斷添加新鮮培養(yǎng)液，及時(shí)補(bǔ)充被藻吸收后減少了的某些元素。
5）注意pH變化?如變動(dòng)過(guò)大，可用酸、堿調(diào)節(jié)。
6）適當(dāng)控制培養(yǎng)物中藻細(xì)胞濃度?過(guò)高會(huì)引起光照和無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)不足，并導(dǎo)致pH上升。一般控制在0.3g（干重）/L范圍內(nèi)。
7）及時(shí)觀察和檢查藻類生長(zhǎng)情況?可以通過(guò)培養(yǎng)物呈現(xiàn)的顏色、藻類細(xì)胞運(yùn)動(dòng)情況、是否有沉淀附壁、菌膜及敵害生物污染跡象等觀察而了解一般的生長(zhǎng)情況。藻種和中繼培養(yǎng)每半月進(jìn)行一次全面顯微鏡檢查。大量培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)有不正?，F(xiàn)象，應(yīng)立即鏡檢，目的有兩個(gè)：了解藻細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并檢查有無(wú)敵害生物污染。
（3）采收：培養(yǎng)液中藻體的適時(shí)采收，既是培養(yǎng)的目的，也是繼續(xù)培養(yǎng)的手段。因?yàn)橥ㄟ^(guò)采收一部分藻體，可使藻細(xì)胞濃度保持恒定。通常在培養(yǎng)物細(xì)胞濃度達(dá)到干重0.4～0.5克/升時(shí)，即可采收培養(yǎng)總量1/3的藻體。
采收時(shí)，先攪拌培養(yǎng)物，取出1/3量藻液，置于沉淀缸中，加入2％～3％明礬或6％飽和石灰水。約1～2小時(shí)，藻細(xì)胞即可完全沉淀，取出沉淀，離心、濃縮、烘干。在大型培養(yǎng)池中采收藻體，可另外設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)墓に嚵鞒獭?/span>