第一章 藻種的分離技術(shù)

第一節(jié) 采樣方法

水樣可以取自任何有可能生長所需單胞藻的水體，通常在海岸邊退潮后留下的小水洼中或者在養(yǎng)殖場、鹽場等地方的小水坑中，生長有適合靜水培養(yǎng)的單胞藻類，而且比較純。在實(shí)驗(yàn)場、育苗場的一些水池、水桶中都有可能出現(xiàn)比較純的藻類。采樣時要同時測定水樣的溫度和鹽度，供分離、培養(yǎng)時參考。

水樣采回后，進(jìn)行現(xiàn)微鏡檢查，如果需要分離的藻類比較多，可以立即進(jìn)行分離。如果在水樣中有需要的藻類，但是數(shù)量不多，就要進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，待其繁殖起來后再分離。預(yù)培養(yǎng)可以用500ml的三角燒瓶，加入150ml的培養(yǎng)液，然后把經(jīng)350目篩絹過濾的水樣150ml接種進(jìn)去，在一定的溫度和光照下靜止培養(yǎng)，每天搖動1~2次。用作預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)液，可選擇各類藻類通用的培養(yǎng)液配方或者同時采用幾種不同藻類的培養(yǎng)液同時分別培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)的培養(yǎng)液的濃度應(yīng)小些，一般只用原配方的1/2或1/4。如果要分離的藻類的最適生長條件是已知的，那就在其最適的光照和溫度下培養(yǎng)。如果不知其最適生長條件，那就在人為設(shè)定的條件下培養(yǎng)，以便適應(yīng)應(yīng)用時的特定環(huán)境。

第二節(jié) 分離方法

一、微吸管分離法

用直徑0.5厘米、長35厘米的普通玻璃管，在中央部分加熱，拉長6~10厘米，使玻璃管的直徑縮小至0.06~0.1厘米，把它折斷后即成二個吸管。把一團(tuán)棉絮塞進(jìn)吸管的寬大一端，然后放入高壓滅菌器中消毒。消毒后，再在酒精燈上加熱吸管的細(xì)端，用鑷子拉成極細(xì)的微管，直徑縮小至0.08~0.16毫米即可。微吸管在入水的瞬間，因毛細(xì)管的作用會吸入微量的水。將藻液水樣放在凹玻片上，在顯微鏡下用微吸管仔細(xì)地吸出單個藻體，滴在載玻片上，在顯微鏡下確認(rèn)是所要分離的單個藻體后，移入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

二、平板分離法

按所要分離的藻類的特性，選用合適的培養(yǎng)液，在培養(yǎng)液中加入1~1.5%的瓊脂，加熱將瓊脂溶化。加熱后要加淡水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水分。然后，按照微生物學(xué)中固體培養(yǎng)基的制作方法倒平板、滅菌。

在無菌操作箱中，用接種針蘸取少量藻液，在固體培養(yǎng)基上劃蛇形線，藻細(xì)胞就會散布在瓊脂培養(yǎng)基的表面。

另一種使藻細(xì)胞散布在培養(yǎng)基表面的方法是用醫(yī)用口腔噴霧器，將經(jīng)稀釋的藻液噴在培養(yǎng)基的表面。

將接種好的培養(yǎng)皿放在有適合的光照和溫度的地方培養(yǎng)。一般經(jīng)過十來天的培養(yǎng)就會在培養(yǎng)基上長出相互間隔的藻落。通過顯微鏡檢查，找出所要的純的藻落，再用已消毒的接種針從培養(yǎng)基上挑取藻體，移入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

三、水滴分離法

先將欲分離的藻液稀釋，用微吸管將少量藻液吸出，滴在載玻片上，每張載玻片上可以滴數(shù)滴。水滴大小以在低倍顯微鏡下一個視野能包括整個水滴為準(zhǔn)。在顯微鏡下逐個觀察水樣，挑選水滴中只有所要分離的單個藻體，而沒有其他任何雜藻或小動物的，移入經(jīng)滅菌的培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

四、稀釋分離法

用已消毒的試管5支，在第一支試管中加蒸餾水10毫升，第二和第五支試管都加5毫升，用高壓蒸汽消毒，待冷卻后，在第一支試管中滴入混合藻液1滴，充分震蕩，使其均勻稀釋。再用經(jīng)消毒的吸管從第一支吸管中吸取5毫升到第二支吸管中，充分震蕩后再取5毫升到第三支試管中，如此直至第五個試管。再取5個已裝有消毒的培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，加熱使培養(yǎng)基熔化，待冷卻而尚未凝固時，分別滴入5個試管中的藻液各1滴，用力震蕩，使藻液充分混入培養(yǎng)基中。等冷凝后將培養(yǎng)皿放在適合的條件下，直到培養(yǎng)基中出現(xiàn)藻落。在稀釋適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)皿內(nèi)，藻落和細(xì)菌群落會充分分離。再在無菌條件下將選取單個藻落接種到固體培養(yǎng)基的表面，再培養(yǎng)。重復(fù)數(shù)次，直至得到純的藻落。

第二章 藻種的保存技術(shù)

保存藻種時可以根據(jù)保種目的和保種條件的不同分別采取不同的保種方法。

第一節(jié) 固體培養(yǎng)基保存法

此法通常把藻種接種在固體培養(yǎng)基上，在弱光低溫條件下保存，接種一次可以保存半年到一年。

保種用的固體培養(yǎng)基的營養(yǎng)濃度應(yīng)比正常的液體培養(yǎng)液的高，一般增加一倍。瓊脂量為1~1.5%。保種用的培養(yǎng)容器可用三角燒瓶、試管和克氏扁瓶。固體培養(yǎng)基分裝滅菌后，冷卻待用。

將無污染的藻種用噴霧法或劃線法接種到固體培養(yǎng)基上，在弱光條件下，讓細(xì)胞在培養(yǎng)基上慢慢地生長繁殖，可保存半年到一年。

可進(jìn)行低溫保存的藻種，最好在低溫環(huán)境中保存。接種后，首先放在光線充足的地方（防止直射光照射），使藻類細(xì)胞較快速地繁殖起來，直到培養(yǎng)基上出現(xiàn)顏色，即可放入冰箱或冷庫中，一般在5℃左右的低溫下保存。當(dāng)然，不同的藻種保存的溫度也不盡相同。每天應(yīng)給藻種幾個小時的弱光照。此法保存的時間可長達(dá)2至3年。如新月菱形藻可保存34個月，三角褐指藻可保存25個月，角毛藻和骨條藻可保存9個月。

第二節(jié)循環(huán)移養(yǎng)保存法

此法采用的容器一般為三角燒瓶（300毫升、500毫升、1000毫升等）和細(xì)口瓶（10000毫升、20000毫升等），將容器、工具消毒后，加入正常濃度的培養(yǎng)液，接種后瓶口用消毒的濾紙包扎，放在適宜的溫度和光照條件下培養(yǎng)。白天搖動瓶子數(shù)次。一般5~10天即可移樣一次。此法簡單、容易掌握，而且保存的藻種活力強(qiáng)、純度高、數(shù)量大。

資源來自：中國科學(xué)院海洋研究所海洋生物種質(zhì)庫