作者：廈門大學(xué) 李峰
在微藻培養(yǎng)過程中，需要了解微藻細(xì)胞的生長情況和速率，這個時候最常用的方法就是生長曲線繪制，這個時候用血球計數(shù)板是最常用的計數(shù)方法。本文作者提供利用血球計數(shù)板計算藻細(xì)胞密度數(shù)量的操作步驟和常見問題。
利用血球計數(shù)板計數(shù)方法
一、血球計數(shù)版計數(shù)所需的儀器和試劑
圖1血球計數(shù)版計數(shù)所需的儀器和試劑
二、魯格試劑的配制
即將6克碘化鉀溶于20ml水中，待其完全溶解后，加入4克碘充分搖動，待碘全部溶解后定容到100ml即配成魯哥氏液。（用棕色玻璃瓶裝）。
固定濃度：每1000毫升水樣加入10-15毫升魯哥氏液。
三、血球計數(shù)版的基本構(gòu)造：
1、基本結(jié)構(gòu)
血球計數(shù)版用優(yōu)質(zhì)厚玻璃制成。每塊計數(shù) 板由H形凹槽分為2個同樣的計數(shù)池。計數(shù)池兩側(cè)各有一支持柱，將特制的專用蓋玻片覆蓋其上，形成高0.1mm的計數(shù)池，如圖所示：
?????????????????????????圖2 血球計數(shù)版結(jié)構(gòu)示意圖
2、計數(shù)區(qū)
計數(shù)區(qū)的刻度：計數(shù)區(qū)分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格。計數(shù)區(qū)邊長為1mm，則計數(shù)區(qū)的面積為lmm2，每個小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后，計數(shù)區(qū)的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3，每個小方格的體積為1/4000mm3，如圖所示：
圖3 計數(shù)區(qū)示意圖,紅色區(qū)域為16個1/400的小方格組成
四、計數(shù)步驟
（1）準(zhǔn)備待測藻液（如果濃度過高，進(jìn)行稀釋），用Lugol’s solution固定。?
（2）取潔凈的血球計數(shù)板一塊，在計數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。
（3）用移液器吸取少許藻液（20μl），從計數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴（如圖4）。
圖4 加樣示意圖
（4）靜置片刻，使細(xì)胞沉降到計數(shù)板上，不再隨液體漂移。將血球計數(shù)板放置于顯微鏡的載物臺上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計數(shù)區(qū)后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察并計數(shù)。
（5）在圖5中區(qū)域（25個中格選5個區(qū)域）進(jìn)行計數(shù)。
（6）每個樣品重復(fù)2-3次。
（7）計算。
??????計算公式為：
五、注意事項
為了保證計數(shù)的準(zhǔn)確性，避免重復(fù)計數(shù)和漏記，在計數(shù)時，對沉降在格線上的細(xì)胞的統(tǒng)計應(yīng)有統(tǒng)一的規(guī)定。如藻細(xì)胞位于大方格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。即位于本格上線和左線上的細(xì)胞計入本格，本格的下線和右線上的細(xì)胞不計入本格。見圖6：
六、使用技巧
血球計數(shù)板在使用中可以用到如下技巧：
- 為了計數(shù)視野清晰，其實可以往水里加點染料，或者加個濾光片，顯微鏡下看反差會大些，用投射光源不要反射光
- 一般計數(shù)的取樣在幾微升，要用移液槍
- 細(xì)胞計數(shù)板在使用一段時間后，顯微鏡下看不清格子，記得每次使用完用稀鹽酸或者酒精清洗。
加入魯格試劑后的藻液可以長期保存后再測嗎
不同藻不一樣的結(jié)果
請問待測藻液一般取多少ml來固定？
一般固定多久
請問魯哥試劑一般固定多長時間